謝 青，陳林林， 李 治，單曉亮， 聶 丹，段玉潔， 權(quán)會琴，唐 霓

(重慶醫(yī)科大學(xué)感染性疾病分子生物學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室，重慶400016)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，長期慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是導(dǎo)致HCC的主要病因［1］。Wnt/β-catenin信號通路是廣泛存在于真核生物中的一條高度保守的信號通路，其異常激活與多種腫瘤如肝癌、子宮癌、黑色素瘤等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2］。研究證實，乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)可以通過異常激活 Wnt/βcatenin信號通路，參與HCC的發(fā)生，但具體機(jī)制不明［3］。

HCC患者中普遍存在異質(zhì)的HBx缺失突變體，表達(dá)截短的HBx蛋白致其功能發(fā)生改變，并極可能參與肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化［4］。為此，我們構(gòu)建了一系列HBx截短突變體，這些區(qū)域涵蓋了已有文獻(xiàn)報道的HCC組織中HBx蛋白自然截短突變的主要位點(diǎn)，并且涉及HBx的反式激活域等功能域。本實驗通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染和熒光素酶報告系統(tǒng)，研究HBx不同截短突變體在細(xì)胞內(nèi)的定位及其對Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)錄活性的影響，探討HBV相關(guān)肝癌的發(fā)生機(jī)制。

材料和方法

1 主要質(zhì)粒和細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞系Huh7、人胚腎上皮細(xì)胞HEK293、真核表達(dá)載體 pAdTrack-TO4-HBx、pEGFP-C1、pTop-Luc以及E.coli DH10B均為本實驗室保存。

2 主要試劑

Taq DNA聚合酶購自TaKaRa;限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ和KpnⅠ、T4 DNA連接酶、Wizard質(zhì)粒提取試劑盒及螢光素酶活性檢測試劑盒均為Promega產(chǎn)品;抗綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)抗體購自碧云天;鼠抗IgG購自Abcam;1%青/鏈霉素和DMEM培養(yǎng)基購自HyClone;胎牛血清購自 Gibco;4′，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4’，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI)購自Roche;LipofectamineTM2000購自 Invitrogen;發(fā)光底物ECL購自Millipore;其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。引物序列見表1，由上海Invitrogen公司合成。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3 主要方法

3.1 HBx截短突變體的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)HBx基因全長序列設(shè)計5對截短體［缺失C端49～154 aa(HBx1)、C 端85～154 aa(HBx2)、N 端1～57 aa+C端141～154 aa(HBx3)、N 端1～57 aa(HBx4)或N端1～84 aa(HBx5)］的引物，以 pAdTrack-TO4-HBx質(zhì)粒作為模板，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增上述截短突變體，反應(yīng)條件:96℃ 2 min，92 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35 個循環(huán)，最后在72℃延伸5 min。取2 μL PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳、用凝膠成像儀記錄。PCR產(chǎn)物用無水乙醇沉淀法純化后克隆入pEGFP-C1載體的HindⅢ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)，T4 DNA連接酶16℃過夜連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH10B感受態(tài)菌。挑選陽性克隆，擴(kuò)增后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定并測序。

3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光顯微鏡觀察 將HEK293細(xì)胞按每孔2×105細(xì)胞鋪于24孔板，待細(xì)胞生長至80%融合率時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將0.5 μg質(zhì)粒和2 μL LipofectamineTM2000稀釋到50 μL無血清DMEM中制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，輕輕混勻，室溫靜置20～30 min。用500 μL無血清DMEM輕輕洗滌細(xì)胞后，加入250 μL無血清DMEM至每孔。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入24孔板，輕輕搖勻后，置CO2孵箱中37℃孵育。轉(zhuǎn)染后4 h用1 mL含10%胎牛血清的DMEM替換轉(zhuǎn)染液。轉(zhuǎn)染后36 h，用4%多聚甲醛固定，DAPI染核后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察HBx和增強(qiáng)型GFP(enhanced GFP，EGFP)融合蛋白的表達(dá)及其細(xì)胞定位。3.3 重組蛋白的Western blotting檢測 取100 μL的細(xì)胞裂解液，裂解瞬時轉(zhuǎn)染各截短突變體基因的HEK293細(xì)胞，收集上清液，每孔上樣量20 μg，12%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，將膜孵以抗GFP抗體4℃過夜。TBST洗膜40 min，HRP酶標(biāo)鼠抗IgGⅡ抗室溫孵育1 h。洗滌后，加入底物發(fā)光劑ECL 1 mL，10 s后吸干發(fā)光劑，用單層透明薄膜包裹后曝光膠片。

3.4 螢光素酶報告基因檢測 按照3.2的方法，Huh7細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染pTOP-Luc報告質(zhì)粒，12 h后重鋪細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后分別轉(zhuǎn)染pEGFP-C1及各HBx不同截短突變體，并設(shè)立空白對照組。轉(zhuǎn)染后24 h，按照Promega公司螢光素酶檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測pTOP-Luc螢光素酶活性。具體方法:將24孔板中的細(xì)胞用PBS充分洗滌后，每孔加入100 μL的1×Passive Lysis Buffer，充分裂解細(xì)胞約10～15 min后，將其收集于1.5 mL EP管中，室溫14 000 r/min離心10 min。取50 μL上清于另一1.5 mL EP管中，加入20 μL螢光素酶底物工作液，充分混勻后再立即用螢光發(fā)光計測量螢火蟲螢光素酶的活性。每組的相對螢光素酶活性用實驗組螢火蟲螢光素酶活性與對照組螢火蟲螢光素酶活性的比值來表示。實驗重復(fù)3次。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

每次實驗設(shè)3個復(fù)孔，進(jìn)行獨(dú)立的3次重復(fù)實驗。用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HBx截短突變體目的基因的PCR擴(kuò)增

以pAdTrack-TO4-HBx為模板，分別用相應(yīng)引物擴(kuò)增目的基因 HBxWT、HBx1、HBx2、HBx3、HBx4和HBx5，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳顯示，DNA片段的大小分別約為 462 bp、144 bp、255 bp、248 bp、290 bp和209 bp，與預(yù)期結(jié)果一致，見圖1、2。切下目的條帶，用膠回收試劑盒回收DNA，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，為單一條帶DNA。

Figure 1.Schematic diagram of HBx-truncating mutation constructs.HBxWT:full length of HBx protein;HBx1:1～48 aa of HBx protein;HBx2:1～84 aa of HBx protein;HBx3:58～140 aa of HBx protein;HBx4:58～154 aa of HBx protein;HBx5:85～154 aa of HBx protein;fHBxWT，fHBx1，fHBx2，fHBx3，fHBx4 and fHBx5:fusion proteins of HBxWT，HBx1，HBx2，HBx3，HBx4and HBx5with EGFP，respectively.圖1 HBx截短突變體結(jié)構(gòu)模式圖

Figure 2.PCR products of HBx truncated mutants.Lane 1:HBxWT(462 bp);Lane 2:HBx1(144 bp);Lane 3:HBx2(255 bp);4:HBx3(248 bp);Lane 5:HBx4(290 bp);Lane 6:HBx5(209 bp);Lane 7:pEGFP-C1 vector(47 000 bp);M1:DNA marker 2000;M2:DNA marker λ-EcoT14Ⅰ.圖2 HBx截短突變體的PCR擴(kuò)增

2 HBx截短突變體重組質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒 fHBxWT，1～5用 HindⅢ和 KpnⅠ雙酶切后，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，可見約4.7 kb的pEGFPC1 質(zhì)粒片段和 462 bp、144 bp、255 bp、248 bp、290 bp和209 bp的目的基因片段，符合預(yù)期結(jié)果，見圖3。重組質(zhì)粒測序鑒定，證實克隆片段序列與HBx全長基因組中的對應(yīng)序列相一致，且插入方向正確。

Figure 3.Identification of HBx-truncating mutation recombinant plasmids digested by restricted enzymes HindⅢand KpnⅠ.Lane 1:fHBxWT;Lane 2:fHBx1;Lane 3:fHBx2;Lane 4:fHBx3;Lane 5:fHBx4;Lane 6:fHBx5;Lane 7:pEGFP-C1 vector;M1:DNA marker 2000;M2:DNA marker λ-EcoT14Ⅰ.圖3 HBx截短突變體重組質(zhì)粒的酶切鑒定

3 HBx截短突變體重組質(zhì)粒的表達(dá)

融合 EGFP的 HBx截短突變體瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。48 h后收集細(xì)胞總蛋白，Western blotting檢測各截短突變體的表達(dá)情況，均檢測到與預(yù)計相對分子量相一致的融合表達(dá)蛋白，見圖4。

4 HBx截短突變體在HEK293細(xì)胞中的定位

融合EGFP的HBx截短突變體瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。36 h后固定細(xì)胞，DAPI染核后于激光共聚焦顯微鏡下觀察HBx不同截短突變體在HEK293細(xì)胞中的定位。fHBxWT主要定位于HEK293細(xì)胞的胞質(zhì)中，呈不均一的粗大顆粒，胞核中也有少量表達(dá)。N端缺失突變體(fHBx4和fHBx5)主要定位于細(xì)胞核周胞質(zhì);C端缺失突變體(fHBx1和 fHBx2)在胞質(zhì)胞核中則呈均勻分布;N端1～57 aa+C端141～154 aa缺失突變體(fHBx3)的細(xì)胞定位情況則類似于fHBxWT，見圖5。

5 HBx截短突變體對Wnt/β-catenin轉(zhuǎn)錄活性的影響

本實驗中，報告質(zhì)粒pTOP-Luc帶有6個能夠被β-catenin識別的 T細(xì)胞因子 4(T-cell factor 4，TCF4)重復(fù)序列，其螢光素酶的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄復(fù)合物β-catenin/TCF4的調(diào)節(jié)，兩者呈正相關(guān)關(guān)系。因此，報告基因產(chǎn)物的螢光素酶活性反映了 β-catenin/TCF4活性，即經(jīng)典Wnt通路的活性。在Huh7細(xì)胞中外源轉(zhuǎn)染fHBxWT后螢光素酶活性約為空白對照組的 69.5 倍，轉(zhuǎn)染 fHBx1、fHBx2、fHBx3、fHBx4和 fHBx5后其螢光素酶活性較fHBxWT明顯下降，分別下降了78.7%、84.7%、75.7%、93.8%和95.5%，見圖6。

Figure 4.The expression of fusion proteins of HBx truncated mutants with EGFP in HEK293 cells.Vector:EGFP protein;mock:total protein of HEK293 cells.GAPDH served as a loading control.圖4 HBx截短突變體重組質(zhì)粒融合蛋白的表達(dá)

Figure 5.The expression and location of fusion proteins of HBx-truncated mutants with EGFP in HEK293 cells.Nuclei were stained with DAPI.Scale bar=50 μm.圖5 HBx截短突變體重組質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中的定位

Figure 6.Effects of HBx truncated mutants on β-catenin/TCF4 transcriptional activity of Wnt signaling pathway in Huh7 cells.1:empty cell control;2:pEGFP-C1 vector;3:fHBxWT;4:fHBx1;5:fHBx2;6:fHBx3;7:fHBx4;8:fHBx5.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 3.圖6 Huh7細(xì)胞中HBx截短突變體對Wnt/β-catenin轉(zhuǎn)錄活性的影響

討 論

HBx基因定位于HBV基因組第1 374～1 836位核苷酸之間，是HBV DNA中最小的開放讀碼框，也是功能重疊最明顯的區(qū)域，編碼由145～154個氨基酸組成、分子量約為17 kD的HBx蛋白。根據(jù)HBx蛋白的氨基酸序列與土撥鼠肝炎病毒(woodchuek hepatitis virus，WHV)和地松鼠肝炎病毒(ground squirrel hepatitis virus，GSHV)序列的同源性，將HBx分成 A(1～20 aa)、B(21～57 aa)、C(58～84 aa)、D(85～119 aa)、E(120～140 aa)和 F(141～154 aa)6個區(qū)域。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，HBV DNA尤其是HBx基因頻繁整合于宿主基因組，導(dǎo)致染色體的不穩(wěn)定和缺失突變體的發(fā)生，與 HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Hoare等［5］發(fā)現(xiàn)在 18例肝癌患者中有 10例(58.8%)存在 HBx缺失突變。Chen等［6］對 HBsAg陽性的肝癌患者進(jìn)行HBx檢測，通過序列比對，發(fā)現(xiàn)大部分腫瘤HBx蛋白存在羧基端缺失。另外，研究發(fā)現(xiàn)在一些HCC癌組織中分別發(fā)現(xiàn)了C端截短20或35個氨基酸的HBx截短體［7-9］。因此，在肝癌組織中HBx蛋白的缺失突變，尤其是C端缺失是一個主要特征。C端缺失突變的HBx具有完全不同于野生型HBx的功能。腫瘤組織中的HBx缺失突變體能夠抑制野生型HBx抗增殖和反式激活能力，而C端缺失突變體則能增強(qiáng)原癌基因ras及c-myc的轉(zhuǎn)化能力，并明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖與浸潤能力［10-13］。同時，越來越多的證據(jù)也證實，HBx缺失突變體可以通過p53、NF-κB等途徑取消野生型HBx所具有的促細(xì)胞凋亡能力［14］。因此，HBx的不同缺失突變，尤其是C端的缺失，使其在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及轉(zhuǎn)化的過程出現(xiàn)紊亂，可能與HCC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

通過我們的實驗發(fā)現(xiàn)，HBx不同編碼區(qū)缺失突變體在HEK293細(xì)胞中的定位不同，這可能與細(xì)胞中HBx表達(dá)水平的高低密切相關(guān)。有研究表明，在瞬時轉(zhuǎn)染過表達(dá)系統(tǒng)中，HBx主要位于胞漿并附著包膜，小部分在核內(nèi)。HBx保留有核輸出信號，可與核受體Crm-1結(jié)合，誘導(dǎo)HBx的出核。另外，HBx還可以與一些轉(zhuǎn)入因子如p53、Smad4相互作用，從而誘導(dǎo)HBx在胞漿與胞核之間的穿梭調(diào)節(jié)［15］。HBx具有廣泛的轉(zhuǎn)錄激活能力，可通過激活胞漿信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或直接與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)控宿主基因的表達(dá)。HBx的這種雙重轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用與其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平以及細(xì)胞定位密切相關(guān)。當(dāng)HBx在細(xì)胞中呈低量表達(dá)時，它主要分布于胞核，通過與轉(zhuǎn)錄因子(如CREB、AP-1等)或基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄元件TATA結(jié)合蛋白等相互作用直接調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄效應(yīng);當(dāng)在細(xì)胞中高水平表達(dá)時，HBx則主要聚集在胞質(zhì)，通過影響線粒體功能，從而干預(yù)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，參與對細(xì)胞增殖、凋亡等的調(diào)控［16］。

Wnt信號通路是真核生物中的一條廣泛存在的高度保守的信號通路，在胚胎的發(fā)育過程中起到重要的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤等［2］。胞漿內(nèi) β-catenin表達(dá)或穩(wěn)定性增高是腫瘤發(fā)生過程的中心事件，其原因可歸納為三大類:(1)異常Wnt信號，導(dǎo)致β-catenin降解障礙;(2)β-catenin結(jié)構(gòu)改變，不能被磷酸化;(3)參與β-catenin降解調(diào)節(jié)的分子改變，如Wnt信號途徑負(fù)性調(diào)節(jié)子(APC、Axin和β-TrCP)的失活突變、正性調(diào)節(jié)子Dvl過度表達(dá)、Wnt蛋白拮抗劑(如sFRP、WIF-1和DKK-1)的表達(dá)下調(diào)等［2，17-18］。

通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，我們發(fā)現(xiàn)HBx不同編碼區(qū)缺失突變體對Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)錄活性的作用不同。與野生型HBx相比，HBx不同截短突變體對Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)錄活性均明顯下降，可能與HBx缺失突變體對胞漿中β-catenin的表達(dá)及穩(wěn)定性的改變有關(guān)。最近的研究顯示HBx可以通過甲基化E-cadherin啟動子，抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)，從而穩(wěn)定肝癌細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin，使其在胞質(zhì)中積聚，入核后與TCF家族的轉(zhuǎn)錄因子相互結(jié)合，導(dǎo)致下游靶基因異?；罨?，最終參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［19］。此外，HBx還能刺激受體酷氨酸激酶，激活Ras/Raf/MAPK信號通路，穩(wěn)定βcatenin從而異?；罨疻nt信號通路，可能參與HCC的發(fā)生發(fā)展［20］。由此我們推斷:HBx可能通過直接或間接與β-catenin結(jié)合，促使其在細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)聚集，影響其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，其具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

本實驗成功構(gòu)建了一系列HBx N端、C端不同編碼區(qū)缺失突變體和融合EGFP的表達(dá)載體，該區(qū)域涵蓋了已報道的HCC中HBx蛋白自然發(fā)生截短突變的主要位點(diǎn)，為深入研究HBx不同缺失突變體的生物學(xué)功能及其對Wnt/β-catenin信號通路轉(zhuǎn)錄活性的影響研究奠定了基礎(chǔ)。

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