辛 毅， 李 娜， 張 穎， 黃益民， 劉 颯， 許秀芳， 張兆光

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠是將來源于維多利亞多管水母(Aequorea victoria)的發(fā)光蛋白通過轉(zhuǎn)基因技術敲入C57小鼠基因序列中獲得的組織細胞發(fā)出綠色熒光的小鼠，其細胞自發(fā)熒光的特點為干細胞示蹤提供了良好的動物來源［1-2］。目前對GFP轉(zhuǎn)基因小鼠臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)的純化培養(yǎng)未見報道，而骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的分離培養(yǎng)報道也較少。MSCs具有多向分化潛能，在體外適當?shù)恼T導條件下可以分化為骨、脂肪、內(nèi)皮、軟骨、肌肉和神經(jīng)等多種組織細胞，體外培養(yǎng)不丟失其多向分化潛能，GFP小鼠作為良好的示蹤工具提供了一個很好的細胞來源［3］。本實驗擬通過酶消化法培養(yǎng)UCMSCs與密度梯度離心法分離BMSCs，在生物學特性、表面標志及多向分化潛能等方面進行比較，為干細胞示蹤提供了良好的細胞來源及技術方法。

材料和方法

1 動物

孕晚期健康GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，體質(zhì)量50～55 g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，北京市心肺血管疾病研究所實驗動物中心繁殖。

2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素和鏈霉素均為Gibco產(chǎn)品。Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶均為Sigma產(chǎn)品。MTT為Promega產(chǎn)品。成骨和成脂誘導試劑盒(Mesenchymal Adipogenesis Kit和Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis Kit)為Millipore產(chǎn)品。小鼠淋巴細胞分離液為國產(chǎn)試劑。流式抗體 PE-CD90、PE-CD105、PE-CD44、PE-CD45、PE-CD79a、PE-CD19 和 PE-CD14 為 BD 產(chǎn)品;細胞培養(yǎng)板、離心管和培養(yǎng)皿等均為Corning產(chǎn)品。4000B型熒光倒置顯微鏡為Leica產(chǎn)品。CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo Electron產(chǎn)品)。酶標檢測儀(Beckman產(chǎn)品)。超凈工作臺購自北京昌平長城凈化空氣儀器廠，TGL-16C離心機購自上海安亭科學儀器廠。

3 方法

3.1 取材 用0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉孕鼠，75%乙醇消毒腹部，將子宮取出并分離胚胎，剪取臍帶組織，置含雙抗預冷0.01 mmol/L PBS的培養(yǎng)皿中清洗3次，去除血污抗菌，將臍帶用眼科剪剪碎成約1 mm×1 mm×1 mm組織塊，放入50 mL離心管中備用;再用消毒的手術器械無菌分離四肢長骨，去除骨膜及殘留肌肉，剪去長骨兩端，暴露髓腔后放入100 mm培養(yǎng)皿中備用。

3.2 Ⅱ型膠原酶消化分離UCMSCs 將臍帶組織碎塊放入50 mL離心管，再加入2 g/LⅡ型膠原酶，體積為組織的15～20倍為宜。37℃、100 r/min水浴搖床消化60～90 min，吸管輕輕吹打組織塊1～2 min，當臍帶組織塊由白色呈半透明狀態(tài)時，用10%FBS DMEM/F12終止消化，收獲細胞;在其余未完全消化的組織塊中再次加入消化液，是上一次消化液總體積的1/2，消化時間為60 min，余步驟同前;重復消化2～3次，所有的細胞懸液均過200目銅網(wǎng)純化。細胞懸液1 000 r/min離心5 min，棄上清，細胞沉淀中加含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基2 mL，將細胞接種于T25培養(yǎng)瓶，再補充3 mL含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，置體積分數(shù)5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d換液1次。

3.3 密度梯度離心法分離BMSCs 用注射器吸取DMEM/F12培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，收集沖洗液，1 200 r/min離心10 min，棄上清。用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基吹打重懸細胞，制成單細胞懸液，緩緩加入到15 mL裝有小鼠淋巴細胞分離液離心管中，使細胞懸液位于分離液之上，2 500 r/min離心20 min后取出離心管，管中液體分為4層，從上至下為培養(yǎng)基層、單個核細胞層、分離液層及沉淀的紅細胞，用無菌吸頭吸取單個核細胞層置于新的離心管，加入 DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，1 200 r/min離心10 min，棄上清。計數(shù)后以1×1010/L密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，標記為P0，置于體積分數(shù)5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后全量換液，以后每2～3 d換液，棄去未貼壁細胞以達到純化的目的。

3.4 UCMSCs及BMSCs生長曲線的測定 分別取2種原代細胞，按2×107/L接種于24孔培養(yǎng)板，每孔接種1 mL。從接種時間算起，每隔24 h計數(shù)5孔內(nèi)的細胞密度，算出平均值，共計7 d。以培養(yǎng)時間(d)為橫坐標、細胞數(shù)為縱坐標繪制生長曲線。

3.5 MST法測定UCMSCs及BMSCs增殖 分別取2種原代細胞，以每孔約2×104個細胞等量接種于96孔板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)液，置體積分數(shù)5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。每隔1 d向其中5孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，孵育4 h后，用酶標儀在490 nm波長處測定各孔的吸光度 (A490)，每天測5孔，連續(xù)測7 d。設立平行對照孔調(diào)零。

3.6 UCMSCs及BMSCs傳代及純化 細胞生長成致密單層后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，待大部分細胞變圓時，加含100 mL/L FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)液終止消化，反復輕輕吹打，1∶3傳代;依次標記為P1、P2 和 P3。

3.7 UCMSCs及BMSCs周期的測定 分別取P3達到80% ～90%融合細胞，消化、洗滌并計數(shù)2×108/L，700 mL/L冰乙醇固定24 h后，PBS洗滌2次，加 200 μL RNase A(1 g/L)，37 ℃水浴 30 min，再加 PI染色液(50 mg/L)避光反應 30 min，BD FACS Calibur流式細胞儀檢測，Multicycle軟件分析。

3.8 UCMSCs及BMSCs流式細胞術分析 分別取P3細胞，胰蛋白酶消化成單細胞懸液，PBS洗滌2次，分別加入標志物 PE-CD90、PE-CD105、PE-CD44、PE-CD45、PE-CD14、PE-CD79a和 PE-CD19 流式抗體，同時做同型對照，4℃孵育30 min，PBS洗去未標記的抗體，20 g/L多聚甲醛固定后流式細胞術檢測。

3.9 UCMSCs及BMSCs誘導分化潛能的檢測

3.9.1 UCMSCs及BMSCs成脂的誘導 分別取P3細胞，以2×105個接種于6孔板，體外向脂肪細胞誘導分化:含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)至100%融合，換為成脂分化誘導液(10%FBS的DMEM/F12，10 mg/L 胰島素，1 μmol/L 地塞米松，0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基黃嘌呤，100 μmol/L 吲哚美辛，1×105U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素)，連續(xù)誘導30 d后，PBS洗2次，油紅O染液染色30 min，蒸餾水沖洗至背景干凈，蘇木素復染10 min，自來水沖洗3次，在顯微鏡下取圖，并統(tǒng)計油紅O染色的陽性細胞。陰性對照組用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3～4 d換1次液，連續(xù)誘導30 d后，后續(xù)處理與誘導組同時進行并觀察統(tǒng)計細胞數(shù)。

3.9.2 UCMSCs及BMSCs成骨的誘導 分別取 P3細胞，以2×105個接種于6孔板，體外向成骨細胞誘導分化:含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)至80%融合，棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，換成成骨分化誘導液(含體積分數(shù)10%胎牛血清，100 nmol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，0.2 mmol/L 抗壞血酸，1×105U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素)，連續(xù)誘導14 d，在顯微鏡下觀察可見細胞不透明區(qū)域時，PBS洗2次，700 mL/L冰乙醇固定1 h，PBS洗2次，用茜素紅染料1 mL滴加于每孔中，染色20 min后，用PBS洗2次，在倒置顯微鏡下觀察，并統(tǒng)計陽性細胞數(shù)。陰性對照組用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3～4 d換1次液，連續(xù)培養(yǎng)14 d后，后續(xù)染色步驟與誘導組相同并觀察統(tǒng)計細胞數(shù)。

4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 酶消化法分離培養(yǎng)UCMSCs

用Ⅱ型膠原酶消化臍帶組織塊，可以得到較多的單個游離細胞，接種到培養(yǎng)皿里，24 h后可貼壁，1 d后形狀由圓形逐漸變成長梭形，見圖1A;2 d后細胞已開始生長，向四周伸展，呈旋渦狀生長，見圖1B;4 d后貼壁的細胞由中心向周圍不斷生長，細胞排列成復層，細胞生長形狀變得不規(guī)則，相互之間緊密相連，鋪滿平皿底部就可傳代，見圖1C。

Figure 1.Primary culture of UCMSCs by enzyme digestion method(×100).A:1 d;B:2 d;C:4 d.圖1 酶消化法原代培養(yǎng)的UCMSCs

2 密度梯度離心法分離BMSCs

用密度梯度離心法分離BMSCs，可以得到較多的單個游離細胞，接種到培養(yǎng)皿里，24 h后可貼壁，細胞兩端伸出突起，見圖2A，細胞射光性較強;2 d后形狀由長橢圓形逐漸變成短梭形，由中心向四周不斷生長，見圖2B，呈克隆樣生長;4 d后細胞大量生長，呈集聚性長梭形伸展的細胞，排列成單層，細胞生長形狀變得規(guī)則，相互之間緊密相連，鋪滿平皿底部就可傳代，見圖2C。

Figure 2.Primary culture of BMSCs by density gradient separation method(×100).A:1 d;B:2 d;C:4 d.圖2 密度梯度分離法原代培養(yǎng)的BMSCs

3 原代培養(yǎng)UCMSCs及BMSCs生長曲線

比較連續(xù)7 d測定的生長曲線顯示:原代培養(yǎng)的UCMSCs接種0～1 d后，細胞數(shù)明顯增加，比BMSCs數(shù)目增多，差異顯著(P＜0.05);2～5 d為對數(shù)生長期，細胞數(shù)在此段時間內(nèi)達到高峰，比BMSCs數(shù)目增多，差異顯著(P＜0.01);5 d后細胞數(shù)量減少，但細胞數(shù)仍比BMSCs略多，差異顯著(P＜0.01);細胞呈現(xiàn)“潛伏期－對數(shù)生長期－平臺期”的生長模式，細胞生長曲線近似“S”形;原代培養(yǎng)的BMSCs接種0～4 d后，細胞數(shù)緩慢增加，5～7 d后細胞數(shù)也有增加趨勢，細胞生長曲線平緩，未顯示出“S”形特征，見圖3。

4 原代培養(yǎng)UCMSCs及BMSCs MTT測定結(jié)果

原代培養(yǎng)UCMSCs增殖能力測定，連續(xù)7 d測定A490值。UCMSCs生長前2 d與第3天比較有顯著差異(P＜0.05)，提示增殖能力較弱;3～5 d變化較為顯著，提示此段時間內(nèi)細胞增殖較快，可進行傳代;原代培養(yǎng)BMSCs增殖能力的測定，接種細胞后1～4 d，細胞數(shù)目無明顯變化(P＞0.05)，提示此階段增殖能力較弱，5～7 d細胞數(shù)目變化較明顯，前4 d與第5～7天比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示此段時間內(nèi)細胞增殖較快，7 d后可進行傳代。原代培養(yǎng)UCMSCs與BMSCs增殖能力相比較有顯著差異(P＜0.05)，見表1。

Figure 3.The growth curves of primarily cultured UCMSCs and BMSCs.Mean ± SD.n=5.*P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs BMSCs.圖3 原代培養(yǎng)UCMSCs及BMSCs生長曲線

表1 原代培養(yǎng)UCMSCs及BMSCs細胞活力測定Table 1.Viability of primary culture of UCMSCs and BMSCs(Mean±SD.n=5)

5U CMSCs及BMSCs傳代及純化特點

2種方法培養(yǎng)的細胞長至70%～80%即可傳代，2.5 g/L胰蛋白酶消化后，細胞呈單個，亮而圓，1 d后，細胞貼壁，單層生長，呈散在的長梭形，3d后細胞呈密集單層生長，有細胞集落出現(xiàn)，融合率達80%左右，可形成致密的單層;細胞體外培養(yǎng)時，從細胞開始生長3～5 d傳代1次。UCMSCs與BMSCs計數(shù)統(tǒng)計，即細胞的成活率約為97%，表明培養(yǎng)的細胞消化傳代成活率高，見圖4。2種細胞差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

Figure 4.Morphologic changes of UCMSCs(A)and BMSCs(B)in the third passage(fluorescence microscope，×100).圖4P3 UCMSCs及BMSCs形態(tài)特征

6U CMSCs及BMSCs周期分析

流式細胞術分別檢測P3 UCMSCs和BMSCs的G0/G1和S+G2/M百分率，結(jié)果顯示，UCMSCs G0/G1期細胞占85.95%，顯著高于S期與G2/M期細胞之和，見圖5A;BMSCs G0/G1期細胞占87.92%，顯著高于S期與G2/M期細胞之和，見圖5B。2種細胞差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

7 UCMSCs及BMSCs免疫表型流式細胞術檢測結(jié)果

P3 UCMSCs PE-CD44、PE-CD105和 PE-CD90陽性表達率為(65.40 ±1.43)%、(58.90 ±1.67)%和(64.50 ±1.96)%，而 PE-CD79a、PE-CD19、PE-CD14和PE-CD45表達率低，陽性率分別為(12.70±0.45)%、(39.40 ± 0.34)%、(3.40 ± 0.54)%、(31.50 ±0.26)%，見圖 6A;P3 BMSCs PE-CD44、PE-CD105和PE-CD90高表達，為(55.30±1.29)%、(61.90 ± 1.76)% 和(57.90 ± 1.96)%，而 PECD79a、PE-CD19、PE-CD14 和 PE-CD45表達率低，分別為(10.90% ±0.64)%、(27.70 ±2.19)% 、(20.60±0.84)%和(25.90±0.84)%，見圖6B;2種細胞差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

Figure 5.Cell cycle analysis of UCMSCs(A)and BMSCs(B)in third passages.圖5P3代UCMSCs及BMSCs DNA周期分析

8U CMSCs及BMSCs成脂細胞誘導

P3 UCMSCs和BMSCs分別成脂誘導20 d左右，細胞形態(tài)逐漸由長梭形變?yōu)槎趟笮危S著誘導時間的延長，高倍鏡下可見細胞變?yōu)闄E圓形或圓形，細胞質(zhì)內(nèi)有顆粒樣物質(zhì)，胞質(zhì)較多，核較大，空泡，提示脂滴開始形成。隨著誘導時間延長，胞質(zhì)內(nèi)的脂滴增多。誘導后的細胞經(jīng)油紅O染色，可見胞質(zhì)中有大量被染成紅色的脂滴，UCMSCs油紅O染色呈陽性，陽性率為(94.6±3.8)%，見圖 7A;BMSCs陽性率為(30.5±2.6)%，見圖7B。2種細胞的陽性率有顯著差異(P＜0.05)。對照組 P3 UCMSCs和 BMSCs用基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d后，在顯微鏡下觀察未見細胞形態(tài)學變化，油紅O染色均未見胞質(zhì)中紅色的脂滴，即油紅O染色陰性，見圖7C、D。

Figure 6.Flow cytometry analytic results of cellular surface antigens of UCMSCs(A)and BMSCs(B)in the third passage.圖6 P3 UCMSCs及BMSCs細胞免疫表型分析

Figure 7.Adipogenic differentiation of UCMSCs and BMSCs in the third passage(Oil red O staining，× 400).A:UCMSCs(induction group);B:BMSCs(induction group);C:UCMSCs(control group);D:BMSCs(control group).圖7 P3 UCMSCs及BMSCs成脂細胞誘導分化結(jié)果

9U CMSCs及BMSCs成骨細胞誘導

P3 UCMSCs及BMSCs分別成骨誘導15 d左右，細胞形態(tài)逐漸由長梭形變?yōu)轺[片形、三角形或多角形等，細胞外基質(zhì)分泌增多，中央可見類似結(jié)節(jié)狀的結(jié)構(gòu)，部分細胞呈現(xiàn)層疊狀生長，茜紅素染色后可見細胞密集處有紅色的沉著物，呈團狀并向四周放射狀排列，中心顏色明顯加深。UCMSCs茜紅素染色陽性率達(92.5±5.1)%，見圖 8A;BMSCs陽性率為(35.5±3.4)%，見圖8B。2種細胞的陽性率有顯著差異(P＜0.05)。對照組 P3 UCMSCs和 BMSCs用基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d后，在顯微鏡下觀察未見細胞形態(tài)學變化，茜素紅染色均未見紅色的結(jié)節(jié)狀細胞團，即茜素紅染色陰性，見圖8C、D。

Figure 8.Osteogenic differentiation of UCMSCs and BMSCs in the third passage(Alizarin red staining，×100).A:UCMSCs(induction group);B:BMSCs(induction group);C:UCMSCs(control group);D:BMSCs(control group).圖8 P3 UCMSCs和BMSCs成骨細胞誘導分化結(jié)果

討 論

熒光蛋白標記技術是近年來高速發(fā)展的一種細胞標記技術，采用基因嵌合的方式將熒光蛋白基因嵌合入待標記的細胞。GFP基因是研究活細胞中基因表達和定位的新型報告基因，被廣泛應用于移植干細胞的體內(nèi)示蹤，但其細胞標記的時效性極不穩(wěn)定，熒光容易淬滅［4］。而熒光蛋白轉(zhuǎn)基因動物則不存在標記不穩(wěn)定的缺陷，細胞體外擴增傳代和體內(nèi)分化均不會引起熒光強度減弱或淬滅，可以提供熒光穩(wěn)定、獲取簡便的示蹤細胞［5-6］。

目前國內(nèi)對于BMSCs分離純化和培養(yǎng)的研究中，采用GFP轉(zhuǎn)基因小鼠進行研究的比較少，在GFP小鼠臍帶中分離MSCs進行體外培養(yǎng)的技術方法未見報道。有研究表明，臍帶中富含干細胞，遠遠高于骨髓中的含量，臍帶間充質(zhì)干細胞有望取代骨髓間充質(zhì)干細胞成為組織工程中更為理想的種子細胞［7］。本研究利用GFP轉(zhuǎn)基因小鼠作為細胞供體，采用酶消化法消化臍帶組織的方式獲得數(shù)量充足的UCMSCs，且操作簡單易行，可更好地保持細胞活力，細胞呈長梭形旋渦狀生長且增殖能力較強，3 d后即可傳代，細胞在短期內(nèi)增殖迅速，縮短了原代培養(yǎng)時間。BMSCs可以通過貼壁細胞分離法、密度梯度離心法、流式細胞儀分選法和免疫磁珠分離法進行分離［8］，本研究利用密度梯度離心法分離BMSCs，操作較復雜，能夠獲取較均一的單個核細胞但細胞數(shù)量較少，細胞貼壁慢，呈成纖維狀克隆樣生長，原代培養(yǎng)7 d后才能傳代，傳代培養(yǎng)時間較長。臍帶MSCs與骨髓MSCs相比較，分離細胞操作簡單且數(shù)量多;原代培養(yǎng)細胞貼壁時間快，所用時間短，短期內(nèi)迅速增殖，臍帶源MSCs可為后續(xù)實驗提供充足的細胞。

為了更加深入地比較2種源性干細胞的生長增殖特性，本研究采用生長曲線法、MTT法和DNA周期檢測細胞生物學特性，其結(jié)果顯示:原代培養(yǎng)的UCMSCs在3～5 d生長迅速，即可傳代;BMSCs于8 d后迅速增殖且可以傳代，細胞增殖生長曲線與MTT結(jié)果相一致。UCMSCs與BMSCs比較，UCMSCs原代培養(yǎng)所需時間較短，在短期內(nèi)可獲得數(shù)量較多的細胞，為基礎研究提供充足的靶細胞。通過對第3代UCMSCs、BMSCs經(jīng)DNA周期檢測法分析，其結(jié)果顯示，85%的細胞處于G0/G1期，只有接近15%的細胞處于 S+G2/M期，符合干細胞生長特性［9］。從DNA周期結(jié)果可以得出，2種源性的MSCs傳代后增殖潛力基本一致，具有典型干細胞增殖特點，將對深入了解細胞的生長發(fā)育有重要意義。

目前尚未明確MSCs的特異性抗原標志，不同的實驗室分離和擴增MSCs的條件差異很大，通常以細胞形態(tài)、流式細胞術檢測結(jié)果和多向分化潛能作為判斷標準［10］，對細胞的分子免疫表型、分化潛能及功能的鑒定亦有不同，有一些比較公認的表面分子標志，包括 CD29、CD73、CD90、CD105、CD44 等，同時不表達造血干細胞的表面標志，包括 CD14、CD45、CD11b、CD34 等［11］，本研究對第 3 代 UCMSCs及BMSCs經(jīng)流式細胞術檢測高表達間充質(zhì)細胞標志CD105、CD90和 CD44，而低表達血源性標志物CD45、CD19、巨噬細胞表面分化抗原CD14及B細胞表面抗原CD79a，2種源性細胞無明顯差異。

為驗證GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的UCMSCs及BMSCs的多向分化潛能，在不同培養(yǎng)條件下，本研究采用成脂及成骨誘導試劑盒對第3代細胞進行體外誘導。結(jié)果表明:UCMSCs和BMSCs經(jīng)成脂及成骨誘導培養(yǎng)后，通過油紅O染色證實分化為脂肪細胞，經(jīng)茜紅素染色證實分化為成骨細胞。臍帶MSCs向脂肪細胞及成骨細胞分化潛能遠遠高于骨髓MSCs，臍帶MSCs將更有利于干細胞的實驗研究及臨床應用。

綜上所述，本研究建立了GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的UCMSCs和BMSC原代培養(yǎng)方法，通過對2種源性細胞進行體外傳代培養(yǎng)、生長增殖特性、細胞表型鑒定、誘導分化潛能等的生物學特性的對比研究，證實UCMSCs可作為一種方便、高效的示蹤干細胞，為研究干細胞龕調(diào)控機制打下良好的細胞學基礎。

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