李 麗， 劉文彥， 劉 瑩

正常的呼吸節(jié)律和幅度是維持生命體穩(wěn)態(tài)的必要條件，同時(shí)，當(dāng)生命體內(nèi)環(huán)境中各種理化因素發(fā)生變化時(shí)，呼吸也會(huì)有相應(yīng)的變化。缺氧是調(diào)節(jié)呼吸的一種常見的化學(xué)因素，輕、中度的缺氧可刺激外周化學(xué)感受器引起呼吸興奮，但重度的缺氧往往可以直接損害呼吸中樞神經(jīng)元，引起呼吸抑制，甚至死亡［1］。所以，尋求對(duì)抗缺氧性呼吸抑制的藥物有重要意義。丹紅注射液是由丹參和紅花兩味中藥按科學(xué)配方提取的復(fù)方中藥制劑，具有擴(kuò)張腦血管、增加腦血流量、抑制血小板聚集和脂質(zhì)過氧化損傷、促進(jìn)缺氧后大鼠軸突功能再生、修復(fù)各種遲發(fā)型神經(jīng)元損傷、加速神經(jīng)功能恢復(fù)等作用［2］。因此我們推測(cè)，丹紅注射液可能抵抗呼吸中樞神經(jīng)元的缺氧性損傷，進(jìn)而對(duì)呼吸抑制起到保護(hù)作用。酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)屬于非電壓門控的對(duì)Na+有通透性的離子通道，由胞外酸化所激活，在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)。ASIC1a是ASICs的一種亞型，當(dāng)pH值小于6.9而不是遠(yuǎn)低于正常pH時(shí)，ASIC1a即可被激活［3］。缺氧時(shí)，細(xì)胞無(wú)氧糖酵解增強(qiáng)，組織酸化，ASIC1a易被激活。已有研究表明，缺氧時(shí)ASIC1a表達(dá)明顯增加，且缺氧的程度與ASIC1a的表達(dá)呈正相關(guān)，預(yù)孵育ASIC1a特異阻斷劑psalmotoxin 1可以減輕體外缺血缺氧引起的神經(jīng)元損傷［4］。以上研究結(jié)果提示ASIC1a參與了缺氧性損害這一病理過程。因此，在本研究中，首先以膈肌肌電為呼吸指標(biāo)，觀察丹紅注射液對(duì)大鼠的缺氧性呼吸抑制有無(wú)保護(hù)作用;其次，采用免疫組織化學(xué)的方法，在缺氧大鼠腦干，檢測(cè)丹紅注射液對(duì)ASIC1a表達(dá)的影響，以期探討其缺氧保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)選用健康成年SD大鼠共24只，雌雄不限，體重250～300 g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 丹紅注射液購(gòu)自菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司;ASIC1a抗體和免疫組化染色試劑盒均購(gòu)自上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司。

2 方法

2.1 丹紅注射液缺氧性呼吸抑制保護(hù)作用的觀察健康成年SD大鼠24只隨機(jī)分為4組，即空氣對(duì)照組、單純?nèi)毖踅M、缺氧加丹紅組和單純丹紅組。動(dòng)物經(jīng)20%烏拉坦(1 g/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，頸部氣管插管，切斷雙側(cè)迷走神經(jīng)，于劍突下打開腹腔并暴露膈肌，并在膈肌上找到合適位置連接電極，以膈肌肌電記錄呼吸運(yùn)動(dòng)的變化。手術(shù)完成待其恢復(fù)30 min開始觀察。對(duì)于空氣對(duì)照組動(dòng)物，從氣管插管側(cè)管通入流量為200 mL/min的空氣;對(duì)單純?nèi)毖踅M動(dòng)物，向其氣管插管側(cè)管通入相同流量的純N2;對(duì)缺氧加丹紅組動(dòng)物，除向其氣管插管側(cè)管內(nèi)通入相同流量的純N2外，在麻醉前30 min和缺氧前30 min(手術(shù)完成后)分別腹腔注射丹紅注射液(10 mL/kg);對(duì)單純丹紅組動(dòng)物，除向氣管插管側(cè)管通入相同流量的空氣外，其余同缺氧加丹紅組。所有動(dòng)物自通入氣體前10 min開始，以每10 min為1個(gè)間隔，記錄1次膈肌肌電，每次記錄1 min。膈肌肌電呼吸的變化以吸氣時(shí)程(inspiratory time，TI)、呼氣時(shí)程(expiratory time，TE)、呼吸頻率(respiratory frequency，RF)和吸氣幅度(amplitude of inspiration，Amp)為指標(biāo)經(jīng)BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行觀察和分析。

2.2 ASIC1a表達(dá)的檢測(cè) 我們的研究資料表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，缺氧30 min時(shí)，動(dòng)物呼吸出現(xiàn)明顯抑制，因此，我們選擇通入氣體30 min為取材時(shí)間。動(dòng)物經(jīng)左心室插管，先后經(jīng)生理鹽水和40 g/L多聚甲醛溶液各250 mL灌流固定腦組織;取腦干于40 g/L多聚甲醛溶液后固定8 h;200 g/L蔗糖磷酸緩沖液中過夜至腦干下沉;液氮冷凍;恒溫冰凍切片機(jī)從延髓尾端至腦橋頭端連續(xù)冠狀切片(片厚40 μm);每6張切片取1張并進(jìn)行ASIC1a免疫組化染色。

切片處理如下:PBS(0.01 mol/L，pH 7.4，下同)漂洗3 min×3次;Triton X-100 37℃孵育30 min，PBS漂洗3 min×3次;30 mL/L過氧化氫孵育20 min，蒸餾水漂洗3 min×2次，PBS漂洗3 min×3次;滴加封閉用正常羊血清，37℃孵育1 h;滴加兔抗鼠ASIC1a抗體(1∶100)，37 ℃孵育 2 h，4 ℃過夜，PBS漂洗3 min×3次;滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，37℃孵育2 h，PBS漂洗3 min×3次;滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37℃孵育2 h，PBS漂洗3 min×3次;DAB室溫顯色，PBS漂洗2次終止反應(yīng);裱片;晾干后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。

利用HPIAS-1000高清病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)細(xì)胞測(cè)量程序測(cè)定腦干ASIC1a陽(yáng)性神經(jīng)核團(tuán)免疫組化染色的灰度值及陽(yáng)性神經(jīng)元個(gè)數(shù)。對(duì)于每張切片的某個(gè)神經(jīng)核團(tuán)，隨機(jī)取5個(gè)高倍視野測(cè)定其灰度值，此例動(dòng)物所取切片該核團(tuán)的平均灰度值即為該例動(dòng)物該核團(tuán)的灰度值。在每張切片的某個(gè)核團(tuán)，取5個(gè)不重疊的視野計(jì)數(shù)其陽(yáng)性神經(jīng)元個(gè)數(shù)，此例動(dòng)物所取切片該核團(tuán)的陽(yáng)性神經(jīng)元個(gè)數(shù)之和除以所取切片數(shù)即為該核團(tuán)的陽(yáng)性神經(jīng)元個(gè)數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS分析軟件，組間均數(shù)比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 丹紅注射液對(duì)缺氧性呼吸效應(yīng)的影響

對(duì)空氣對(duì)照組和單純丹紅組動(dòng)物，吸入空氣前后呼吸無(wú)明顯變化(P＞0.05)。對(duì)單純?nèi)毖踅M動(dòng)物，缺氧即刻、缺氧后第10 min和20 min較缺氧前的TI和TE明顯縮短，RF明顯增快，Amp明顯增大(P＜0.05)，即呼吸明顯興奮。缺氧后30 min較缺氧前的TI明顯變短，TE明顯延長(zhǎng)，RF明顯減慢，AMP明顯減小(P＜0.05)，即呼吸出現(xiàn)明顯的抑制。與單純?nèi)毖踅M相比，缺氧加丹紅組在缺氧即刻及缺氧后第10 min、20 min呼吸的變化如同單純?nèi)毖踅M，但缺氧后30 min較缺氧前TI明顯縮短，TE明顯延長(zhǎng)，RF明顯增快(P＜0.05)，Amp與缺氧前相比無(wú)顯著變化(P＞0.05)，即在缺氧后30 min呼吸尚未出現(xiàn)明顯抑制，見圖1、表1。

Figure 1.Effect of Danhong injection on the respiratory inhibition induced by hypoxia in the rats of hypoxia group(A)and hypoxia plus Danhong group(B).圖1 丹紅注射液對(duì)缺氧性呼吸抑制的影響

表1 丹紅注射液對(duì)缺氧性呼吸抑制的作用Table 1.Effect of Danhong injection on respiratory inhibition induced by hypoxia(Mean±SD)

2 丹紅注射液對(duì)缺氧大鼠腦干ASIC1a表達(dá)的影響

空氣對(duì)照組、單純丹紅組、單純?nèi)毖踅M和缺氧加丹紅組腦干均有ASIC1a的表達(dá)，表達(dá)的核團(tuán)主要位于孤束核和斜方體核?？諝鈱?duì)照組和單純丹紅組孤束核和斜方體核ASIC1a的表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。與空氣對(duì)照組和單純丹紅組相比，單純?nèi)毖踅M和缺氧加丹紅組在斜方體核和孤束核的ASIC1a陽(yáng)性神經(jīng)元著色的深度明顯加深，灰度值明顯降低，即ASIC1a的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，但 ASIC1a陽(yáng)性神經(jīng)元的個(gè)數(shù)未見明顯增加(P＞0.05)。與單純?nèi)毖踅M相比，缺氧加丹紅組ASIC1a陽(yáng)性神經(jīng)元的著色深度明顯變淺，灰度值明顯增加，即ASIC1a的表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，但ASIC1a陽(yáng)性神經(jīng)元的個(gè)數(shù)未見明顯減少(P＞0.05)，見圖2、表2。

表2 丹紅注射液對(duì)缺氧大鼠斜方體核和孤束核ASIC1a表達(dá)的影響Table 2.Effect of Danhong injection on the expression of ASIC1a in the nuclei of trapezoid body and solitary tract(Mean±SD)

討 論

1 丹紅注射液對(duì)缺氧性呼吸抑制的作用

在本研究中，大鼠對(duì)缺氧的呼吸效應(yīng)為先興奮后抑制，低氧引起的呼吸興奮完全是通過刺激頸動(dòng)脈體和主動(dòng)脈體外周化學(xué)感受器來實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)閷㈩i動(dòng)脈體和主動(dòng)脈體的傳入神經(jīng)切斷后，低氧所致的呼吸興奮效應(yīng)則消失。同時(shí)，低氧可損傷呼吸中樞神經(jīng)元，進(jìn)而引起呼吸抑制，當(dāng)?shù)脱鯇?duì)呼吸中樞的直接抑制作用大于刺激外周化學(xué)感受器引起的呼吸興奮效應(yīng)時(shí)，呼吸則表現(xiàn)為抑制。缺氧可通過能量耗竭、酸中毒、興奮性氨基酸、鈣超載、自由基、炎癥細(xì)胞因子等多種因素對(duì)呼吸中樞神經(jīng)元造成損傷［5］，進(jìn)而引起呼吸抑制。丹紅注射液主要成分為丹參酮、丹參素、紅花黃素、紅花酮苷等。研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮和丹參素具有降低脂質(zhì)過氧化物損傷、穩(wěn)定生物膜、提高超氧化物歧化酶活性、抗自由基損傷等作用;紅花黃素和紅花酮苷具有減輕興奮性氨基酸、鈣超載及炎癥細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞的損傷等功能［6］。因此，丹紅注射液能明顯減輕缺氧對(duì)神經(jīng)元的損傷。在我們的研究中，丹紅注射液能延遲缺氧性呼吸抑制的產(chǎn)生，延緩缺氧性呼吸抑制的發(fā)生，可能與上述提到的減輕神經(jīng)元缺氧性損害的作用有關(guān)。

2 丹紅注射液延緩缺氧性呼吸抑制發(fā)生的機(jī)制

缺氧時(shí)，由于乳酸堆積和ATP水解產(chǎn)生H+，導(dǎo)致組織酸化，進(jìn)而誘導(dǎo) ASIC1a的開放，引起大量Na+內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞水腫，同時(shí)ASIC1a對(duì)Ca2+也有較大通透性，加重細(xì)胞內(nèi)鈣超載，引起神經(jīng)元壞死，因此，ASIC1a是非谷氨酸依賴性鈣毒性神經(jīng)元損傷的主要參與者［7］。當(dāng)?shù)脱醯雀鞣N化學(xué)性刺激激活外周化學(xué)感受器時(shí)，沖動(dòng)沿傳入纖維首先到達(dá)腦干孤束核，經(jīng)多級(jí)神經(jīng)元的傳遞來調(diào)節(jié)通氣量［8］。因此，孤束核在缺氧所致的呼吸興奮效應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。李麗等［9］、李自成等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，缺氧大鼠出現(xiàn)呼吸抑制時(shí)，斜方體核的Fos蛋白和神經(jīng)元型一氧化氮合酶表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示斜方體核也是參與缺氧性呼吸調(diào)節(jié)的重要核團(tuán)。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，缺氧后孤束核及斜方體核的ASIC1a表達(dá)明顯增加，即孤束核及斜方體核神經(jīng)元缺氧性損傷較嚴(yán)重，這可能是造成缺氧性呼吸抑制的重要原因，而丹紅注射液能明顯降低孤束核和斜方體核ASIC1a的表達(dá)，減輕神經(jīng)元的缺氧性損傷，因此，丹紅注射液能延遲缺氧性呼吸抑制的產(chǎn)生，進(jìn)而保護(hù)機(jī)體免受缺氧性呼吸抑制的損傷。

綜上所述，丹紅注射液能明顯延遲缺氧性呼吸抑制的發(fā)生。丹紅注射液能明顯降低缺氧后孤束核和斜方體核ASIC1a的表達(dá)，因此丹紅注射液延遲缺氧性呼吸抑制發(fā)生的機(jī)制可能與ASIC1a有關(guān)。

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