陳林林， 桂 春， 韋曉敏， 陳力銓， 朱立光

糖尿病心肌病是一種特異性的心肌病變，其特異性的心肌微血管病變?cè)诎l(fā)病過程中起著重要作用。在糖尿病動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)血管生成因子與糖尿病相關(guān)微血管病變的發(fā)生與進(jìn)展密切相關(guān)［1-3］。血管生成因子分為兩類:一類是促血管生成因子，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管生成素1(angiopoietin-1，Ang-1)和血管生成素2(angiopoietin-2，Ang-2);另一類是抑制血管生成因子，包括內(nèi)皮抑素(endostatin)和血管抑素(angiostatin)，這兩類血管生成因子相互作用參與生理性和病理性血管形成。已有研究證實(shí)血管生成正負(fù)調(diào)節(jié)因子的平衡失調(diào)與糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜微血管并發(fā)癥發(fā)生進(jìn)展有關(guān)［2，4］。本研究采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)糖尿病大鼠心肌病模型，檢測(cè) VEGF、Ang-1、Ang-2和 endostatin在心肌組織的表達(dá)，從分子水平和組織功能學(xué)的角度，探討上述指標(biāo)與糖尿病大鼠心肌病之間的關(guān)系。

材料和方法

1 動(dòng)物

選取健康清潔級(jí)8周齡雄性SD大鼠25只，體重180～220 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，每籠2只，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，自由進(jìn)食。

2 主要試劑

STZ(Sigma);多克隆山羊抗 VEGF、Ang-2和GAPDH抗體，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgGⅡ抗，HRP標(biāo)記兔抗山羊IgGⅡ抗(Santa Cruz);多克隆兔抗Ang-1抗體(PTG);多克隆兔抗endostatin(Abcam);鼠抗人單克隆抗體CD31(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);MaxVision試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司);ECL發(fā)光試劑盒(Pierce);血糖儀及血糖試紙(羅氏公司);小動(dòng)物呼吸機(jī)及MPA心功能分析系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司)。

3 主要方法

3.1 動(dòng)物分組和模型建立 將大鼠按電腦隨機(jī)數(shù)法分為正常對(duì)照組(control，n=10)和糖尿病組(diabetes mellitus，DM，n=15)。大鼠禁食 12 h，糖尿病組腹腔內(nèi)注射STZ溶液55 mg/kg，對(duì)照組予等量0.1 mmol/L檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。用血糖儀監(jiān)測(cè)鼠尾靜脈血糖，血糖穩(wěn)定7 d后，以血糖＞16.7 mmol/L并出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象的大鼠納入糖尿病組研究，其中成模大鼠13只。實(shí)驗(yàn)過程中糖尿病組死亡3只。死因可能是感染、糖尿病酮癥酸中毒或糖尿病其它并發(fā)癥。最終共有20只完成實(shí)驗(yàn)。糖尿病組10只，對(duì)照組10只。

3.2 心功能檢測(cè) 分別于造模成功后第12周，給予10%水合氯醛麻醉大鼠，行氣管切開插管，接小動(dòng)物呼吸機(jī)，潮氣量1～2 mL/100 g，自左側(cè)胸骨旁縱行切開，打開胸腔顯露心尖，將含肝素液導(dǎo)管自心尖向心底方向插入左心室腔內(nèi)，導(dǎo)管另一頭連接于壓力換能器，導(dǎo)入MPA心功能分析系統(tǒng)記錄左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末期壓力(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室壓力上升最大速率(+dp/dtmax)、左心室壓力下降最大速率(－dp/dtmax)。

3.3 組織標(biāo)本獲取方法 分別于造模成功后第12周處死大鼠，待檢測(cè)完心功能后迅速取出心臟，用冷PBS洗凈，濾紙吸干，稱取并記錄心臟質(zhì)量，分離心臟左右心室，分別稱量左右心室質(zhì)量，計(jì)算心臟質(zhì)量/體質(zhì)量。將心臟標(biāo)本編號(hào)后，一部分心肌組織用4%多聚甲醛固定，備用于Masson染色和CD31免疫組化染色。一部分心肌組織立即置入液氮中保存用于蛋白印記(Western blotting)檢測(cè)。

3.4 Masson染色方法 取出經(jīng)4%多聚甲醛固定的左心室組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后，將石蠟切片至厚5 mm，行Masson染色。在顯微鏡下，膠原纖維呈藍(lán)紫色，心肌纖維呈紅色。每個(gè)標(biāo)本選取5個(gè)視野，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)分析心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF;膠原面積/總面積)。

3.5 左心室組織CD31免疫組化染色 采用Max-Vision兩步法:取左心室中1/3心室組織.經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片脫蠟和水化后，組織抗原修復(fù)，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性等步驟，加入單克隆抗體CD31在4℃孵育過夜，每張切片加50 μL即用型MaxVision試劑，室溫下孵育15 min，每張滴加100 μL新鮮配制的DAB溶液，沖洗后蘇木素復(fù)染。顯微鏡下觀察:凡呈棕色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞群者均作為1個(gè)血管計(jì)數(shù)，但有平滑肌層及管腔直徑大于20 μm血管排除。計(jì)數(shù)方法:每張染色切片在低倍鏡下選取毛細(xì)血管最高區(qū)域，然后在400倍鏡下選擇5個(gè)不同的視野，運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)分析計(jì)算毛細(xì)血管數(shù)與心肌細(xì)胞數(shù)比值(capillary/myocyte，C/M)。

3.6 左心室組織 VEGF、Ang-1、Ang-2和 endostatin在心肌組織表達(dá)的測(cè)定 采用Western blotting方法測(cè)定大鼠左心室組織 VEGF、Ang-1、endostatin和Ang-2在心肌組織的表達(dá)。取適量大鼠左心室心肌約50 mg，液氮研磨后加入RIPA蛋白裂解液(羅氏公司)500 μL和苯甲基磺酰氟5 μL(碧云天生物技術(shù)有限公司)提取心肌組織總蛋白。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)測(cè)定樣本蛋白含量。蛋白經(jīng)SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，剪出目的條帶，室溫封閉1 h，Ⅰ抗孵育過夜，洗膜10 min，共3次，Ⅱ抗室溫孵育1 h，洗膜后在暗房用ECL發(fā)光試劑盒顯影。用Quantity One成像系統(tǒng)進(jìn)行蛋白條帶的灰度值分析。以目的條帶與內(nèi)參照GAPDH條帶的灰度值比值來代表目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，分析結(jié)果。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用兩樣本均數(shù)比較t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 2組大鼠同期血糖及體重比較

與對(duì)照組比較，糖尿病大鼠隨機(jī)血糖濃度明顯高于對(duì)照組(P＜0.01);造模后大鼠體重較對(duì)照組比較明顯下降，第4、8和12周時(shí)體重顯著低于對(duì)照組(P ＜0.01)，見表1。

表1 對(duì)照組與糖尿病組大鼠隨機(jī)血糖和體重變化Table 1.Changes of random plasma glucose and body weight in control and diabetic rats(Mean±SD.n=10)

2 2組心臟血流動(dòng)力學(xué)及心功能的比較

與對(duì)照組比較，糖尿病組LVEDP明顯增高(P＜0.01)，而 +dp/dtmax和 － dp/dtmax明顯下降(P ＜0.05);左室收縮末壓略有所下降，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);2組心率比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1、表2。

Figure 1.The changes of LVP and ±dp/dtmaxbetween control group and DM group.A:the changes of LVP in control group;B:the changes of LVP in DM group;C:the changes of±dp/dtmaxin control group;D:the changes of±dp/dtmaxin DM group.圖1 2組大鼠心臟左心室壓力變化及左室內(nèi)壓最大上升和下降速率圖

表2 2組大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較Table 2.The changes of HR，LVSP，LVEDP，+dp/dtmaxand－dp/dtmaxin control and diabetic rats(Mean±SD.n=10)

3 2組大鼠心肌組織Masson染色比較

正常大鼠心肌組織經(jīng)Masson染色，在光鏡下未見間質(zhì)及微血管纖維化，而糖尿病組光鏡下見心肌細(xì)胞空泡變，心肌間質(zhì)和微血管纖維化明顯，膠原纖維相互連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，排列紊亂，分布不均，呈天藍(lán)色(見圖2箭頭標(biāo)志)。計(jì)算心肌CVF發(fā)現(xiàn)，糖尿病組心肌CVF較正常組比較明顯增多，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(14.59% ±3.36%vs 2.58% ±0.39%，P ＜0.01)，見圖2。

Figure 2.Masson staining of left ventricular myocardial tissues(×100).A:control group;B:DM group.圖2 2組大鼠左心室心肌組織的Masson染色圖

4 2組左心室組織CD31免疫組化染色結(jié)果

與正常大鼠心肌組織比較，DM組大鼠心肌組織毛細(xì)血管稀疏，計(jì)算心肌C/M值較正常組比較明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.50±0.12 vs 0.43 ±0.11，P ＜0.01)，見圖3。

5 2組左心室組織 VEGF、Ang-1、Ang-2和 endostatin在心肌組織的表達(dá)

Figure 3.Immunohistochemical staining of CD31 in left ventricular myocardial tissues(MaxVision method，× 400).Red arrows indicate CD31 positive in capillary endothelial cells.A:control group;B:DM group.圖3 2組大鼠左心室組織CD31免疫組化染色圖

與正常對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠心肌組織表達(dá) VEGF(0.74 ± 0.10 vs 0.44 ± 0.07)和 Ang-1(0.49±0.06 vs 0.18 ±0.05)明 顯 降 低 (均 P ＜0.05);endostatin較正常對(duì)照組表達(dá)明顯增高(0.49 ±0.10 vs 0.66 ±0.16 ，P ＜0.05);而 Ang-2 無明顯差異(0.54 ±0.12 vs 0.61 ±0.09，P ＞0.05)，見圖4。

Figure 4.The expression of Ang-1，VEGF，Ang-2 and endostatin in myocardium detected by Western blotting.Mean ± SD.n=10.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.圖4 2組大鼠左心室心肌組織VEGF、Ang-1、Ang-2和endostatin的表達(dá)

討 論

糖尿病性心肌病是一種特異性心肌病，為糖尿病的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥之一，其典型病理改變?yōu)樾募〖?xì)胞肥大，心肌間質(zhì)增生及纖維化、心肌局灶性壞死、心肌微血管數(shù)目減少等。本研究以鏈脲佐菌素腹腔注射建立動(dòng)物模型，Masson染色顯示膠原含量較正常組明顯增加，提示心肌間質(zhì)組織出現(xiàn)纖維化;CD31免疫組化顯示C/M比值明顯減低，反映相對(duì)心肌毛細(xì)血管數(shù)減少;心臟血流動(dòng)力學(xué)顯示左室收縮、舒張功能均減退，提示本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成功建立了糖尿病心肌病的動(dòng)物模型。

糖尿病心肌微血管病變?cè)谔悄虿⌒募〔〉倪M(jìn)展過程起著重要作用，揣測(cè)微血管病變與心肌組織局部促血管生成因子和抑制血管生成因子失衡有關(guān)。VEGF是最主要的始動(dòng)促血管生成因子，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、分化啟動(dòng)血管的生成［5］。Sasso等［6］發(fā)現(xiàn)在糖尿病合并冠心病患者心肌中VEGF表達(dá)減少，其作用機(jī)制可能是通過抑制PI3K/Akt通路使心肌微血管形成受限，心肌血管密度減低，側(cè)枝血管形成受限。Ang-1是一個(gè)重要的血管穩(wěn)定因子，通過對(duì)血管平滑肌的招募，促進(jìn)新生血管的成熟，在血管生成后期血管重構(gòu)、成熟和穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用［7］。研究表明Ang-1/Tie-2信號(hào)通路下調(diào)，顯著減弱小鼠對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的招募，新生血管成熟受限，表現(xiàn)為血管功能和結(jié)構(gòu)異常，如通透性增高，血管彎曲變形和不成熟［8］。而上調(diào)Ang-1信號(hào)通路，可以改善缺血心肌的微血管數(shù)目，促進(jìn)血管生成［9］。Ang-1與VEGF協(xié)同參與生理和病理性血管形成，過度VEGF干預(yù)誘導(dǎo)不成熟血管的生成，表現(xiàn)為血管通透性增高，組織水腫，而Ang-1能促進(jìn)新生血管的成熟穩(wěn)定，能有效逆轉(zhuǎn)單一VEGF所引起的血管滲漏［8，10-11］。Shin 等［12］在體外臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及小鼠下肢缺血模型發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的Ang-1并不能有效的增加毛細(xì)血管的密度，聯(lián)合應(yīng)用Ang-1和VEGF促進(jìn)成熟穩(wěn)定的血管形成，改善缺血組織局部血流灌注。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，糖尿病大鼠心肌組織Ang-1和VEGF表達(dá)明顯下調(diào)，提示在糖尿病心肌微血管數(shù)目下降與VEGF和Ang-1在心肌組織下調(diào)有關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

Ang-2是血管生成素家族另一成員，是Ang-1的天然拮抗劑，其競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Tie-2，阻礙Ang-1/Tie-2磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，拮抗Ang-1的血管穩(wěn)定作用［13］;另一方面在VEGF缺乏時(shí)，Ang-2促使內(nèi)皮的凋亡，血管退化，血管數(shù)目減少，而在VEGF增加時(shí)，協(xié)同發(fā)揮促血管生成作用［4］。有研究表明早期Ang-2的過表達(dá)加上持續(xù)的Ang-1表達(dá)能促進(jìn)毛細(xì)血管密度增加，有效增加缺血小鼠下肢血流灌注，單一的Ang-1或Ang-2均不能形成成熟穩(wěn)定的血管，提示這種平衡失調(diào)導(dǎo)致新生血管形成受限［14］。本次研究發(fā)現(xiàn)Ang-2無明顯變化，而VEGF和Ang-1顯著減低，推測(cè)可能相對(duì)Ang-2增高而VEGF不足及Ang-1/Ang-2比例下調(diào)，這種比例失調(diào)導(dǎo)致血管生成障礙，參與糖尿病心肌病微血管病的進(jìn)展。

Endostatin是一種具有潛在抗血管生成的因子，由MMP-2、MMP-9和組織蛋白酶L催化降解膠原XⅧ而產(chǎn)生，其具體的抗血管生成機(jī)制不明。有研究表明endostatin在糖尿病患者動(dòng)脈血管中表達(dá)明顯增高，可能與其上調(diào)MMP-2和MMP-9表達(dá)有關(guān)［15］。Sodha等［16］研究表明血清 endostatin水平與糖尿病冠心病患者側(cè)支循環(huán)的建立呈負(fù)相關(guān)，而與糖尿病患者血糖水平呈正相關(guān)。本次研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素在糖尿病心肌組織表達(dá)上調(diào)，可能是長(zhǎng)期的高血糖，導(dǎo)致胰島素抵抗，晚期糖基化終產(chǎn)物等刺激血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞分泌MMP-2和MMP-9，水解膠原XⅧ增多，從而上調(diào)endostatin的表達(dá)。

綜上所述，糖尿病心肌微血管病變與心肌組織促血管生成因子VEGF和Ang-1表達(dá)減少、抗血管生成因子endostatin過度表達(dá)有關(guān)。VEGF降低使血管生成的啟動(dòng)受限，Ang-1下調(diào)導(dǎo)致血管成熟發(fā)育功能障礙，而過度表達(dá)的內(nèi)皮抑素進(jìn)一步抑制了血管生成，使血管結(jié)構(gòu)和功能異常。同時(shí)相對(duì)Ang-1/Ang-2比例失調(diào)影響糖尿病心肌血管生成?？傊@2類正負(fù)血管生成因子的平衡失調(diào)，導(dǎo)致糖尿病微血管功能障礙，可能是糖尿病心肌病產(chǎn)生的重要機(jī)制。

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