劉江月

糖尿病大血管病變是糖尿病重要并發(fā)癥之一，是糖尿病心腦血管疾病的基礎(chǔ)，已成為糖尿病致死致殘的首要原因，其基本病理變化是動(dòng)脈粥樣硬化。氧化應(yīng)激在糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用［1］。梓醇是從地黃塊根中提取的小分子環(huán)烯醚萜類化合物［2］，具有降血糖、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)［3-5］等藥理學(xué)作用。多項(xiàng)研究表明［6-8］，梓醇通過調(diào)控凋亡蛋白與清除氧化自由基發(fā)揮保護(hù)心血管組織的功能。目前，關(guān)于梓醇是否能夠減輕糖尿病大血管病變，保護(hù)大血管國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究通過高脂飲食誘導(dǎo)Goto-Kakizaki(GK)大鼠主動(dòng)脈病變模型，從氧化應(yīng)激角度，以核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)/血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)信號(hào)通路為靶點(diǎn)，探討梓醇對糖尿病損傷主動(dòng)脈的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物與飼料 清潔級(jí)雄性6月齡GK大鼠50只及Wistar大鼠10只，體重(220±20)g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證為SCXK(滬)2012-0002。普通飼料及高脂飼料(83%普通飼料，15%豬油，1.5%膽固醇，0.5%膽鹽)由濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥品與試劑 梓醇標(biāo)準(zhǔn)品購于上海銘睿科技有限公司，二甲雙胍購自北京天安制藥股份有限公司，糖化血紅蛋白試劑盒購自上海德賽診斷用品有限公司，血脂試劑盒和血糖試紙均購自羅氏生物技術(shù)有限公司，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，Nrf2及HO-1抗體均購自Santa Cruz。

1.3 儀器 AU600型全自動(dòng)生化分析儀，752型紫外分光光度計(jì)，DYCZ-25D型電泳儀，Bio-Rad型濕轉(zhuǎn)儀，BiospectrumAC凝膠成像分析系統(tǒng)，H-750透射電子顯微鏡。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型建立與分組 50只GK大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，選取隨機(jī)血糖大于11.1 mmol/L以上45只分為糖尿病模型組(B組)、二甲雙胍治療組(C組，100 mg·kg－1·d－1)以及梓醇高劑量治療組(D組，100 mg·kg－1·d－1)、中劑量治療組(E 組，50 mg·kg－1·d－1)、低劑量治療組(F 組，10 mg·kg－1·d－1)，均高脂飼料喂養(yǎng)。10只健康雄性Wistar大鼠作為對照組(A組)，普通飼料喂養(yǎng)。B、C、D、E和F組均在飲水中加入Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)0.1 g·L－1·d－1進(jìn)行糖尿病大血管病變造模［9］，造模同時(shí)灌胃給藥，A、B組給予等量的生理鹽水，造模時(shí)間12周。

2.2 標(biāo)本采集及處理 每4周末尾靜脈取血測FBG。12周末所有大鼠禁食不禁水過夜，10%水合氯醛3 mL·kg－1腹腔注射麻醉，快速取血15 mL，分離血清，－20℃冰箱保存待測各項(xiàng)血清指標(biāo)。快速取胸主動(dòng)脈3段，分別置于10%甲醛溶液、預(yù)冷的4%戊二醛溶液及液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血清指標(biāo)檢測 全自動(dòng)生化分析儀檢測總膽固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG);采用化學(xué)熒光法檢測ROS水平，采用硫代巴比妥酸分光光度法檢測MDA和T-AOC水平;采用黃嘌呤氧化酶法間接測定SOD活性;比色法檢測糖基化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin 1c，HbA1c)。

2.4 Western blotting檢測Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)取液氮保存的胸主動(dòng)脈段，提取總蛋白，SDS-PAGE分離蛋白后將Nrf2和HO-1蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，分別用Nrf2和HO-1羊抗鼠Ⅰ抗4℃孵育過夜，TBST振蕩洗滌3次后，Ⅱ抗37℃孵育1 h，TBST振蕩洗滌4次后，ECL發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

2.5 組織學(xué)檢查 取10%甲醛固定的胸主動(dòng)脈段，石蠟包埋后5 mm切片，HE染色，光鏡下觀察。

2.6 透射電鏡觀察 取4%戊二醛固定的胸主動(dòng)脈段，1%鋨酸固定、脫水、包埋，超薄切片后3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察胸主動(dòng)脈壁組織超微結(jié)構(gòu)變化。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 18.0軟件分析，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 梓醇對GK大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)的影響

在實(shí)驗(yàn)過程中每4周檢測大鼠FBG。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與A組比較，B組FBG明顯升高(P＜0.05);與B組比較，C、D、E各組FBG均明顯降低(P＜0.05)，C組與D組降糖效果相當(dāng)，見圖1。

Figure 1.The changes of fasting blood glucose(FBG)in each group.Mean±SD.n=9.#P ＜0.05 vs A group;*P ＜0.05 vs B group.圖1 各組大鼠FBG變化

2 梓醇對GK大鼠HbA1c和血脂的影響

與A組比較，B組HbA1c明顯升高(P＜0.05);與B組比較，C、D、E各組HbA1c均明顯降低(P＜0.05);與 E組比較，D組 HbA1c明顯降低(P＜0.05)而F組HbA1c明顯升高(P＜0.05)，說明梓醇對HbA1c的影響呈明顯劑量依賴性，見圖2。與A組比較，B組TC和TG明顯升高(P＜0.05);與B組比較C、D、E各組TC和TG均明顯降低(P＜0.05);與E組比較，D組TC和TG均明顯降低(P＜0.05)，而F組TC和TG均明顯升高(P＜0.05);與C組比較，D組TC和TG均明顯降低，說明梓醇的降脂效果優(yōu)于二甲雙胍且呈明顯劑量依賴性，見圖3。

3 梓醇對GK大鼠ROS、MDA、T-AOC及SOD的影響

與A組比較，B組血清ROS和MDA含量明顯升高(P ＜0.01);與 B 組比較，C、D、E 各組血清 ROS、MDA含量均明顯降低(P＜0.01);與C組比較，D組血清ROS和MDA含量均明顯降低(P＜0.01);D、E、F各組血清 ROS和 MDA含量差異顯著(P＜0.01);與A組比較，B組血清T-AOC和SOD活性明顯降低(P＜0.01);與 B組比較，C、D、E 各組血清 TAOC和SOD活性明顯升高(P＜0.01);與C組比較，D組血清T-AOC和SOD活性明顯升高(P＜0.05，P＜0.01);D、E、F各組血清T-AOC和SOD活性差異顯著(P＜0.01)。這些結(jié)果說明梓醇具有較強(qiáng)的抗氧化作用，其抗氧化效果優(yōu)于二甲雙胍且呈明顯劑量依賴性，見表1。

Figure 2.Comparison of HbA1c in each group.Mean ± SD.n=9.#P ＜0.05 vs A group;*P ＜0.05 vs B group;△P ＜0.05 vs E group.圖2 各組大鼠糖化血紅蛋白比較

Figure 3.Serum lipid changes in each group.Mean±SD.n=9.#P ＜0.05 vs A group;*P ＜0.05 vs B group;△P ＜0.05 vs E group;▲P ＜0.05 vs C group.圖3 各組大鼠血脂變化

表1 各組大鼠ROS、MDA、T-AOC及SOD水平Table 1.Levels of ROS，MDA，T-AOC and SOD in each group(Mean ±SD.n=9)

4 梓醇對GK大鼠主動(dòng)脈組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的影響

與A組比較，B組大鼠胸主動(dòng)脈組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P＜0.05);與B組比較，C、D、E組大鼠胸主動(dòng)脈組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(P＜0.05);與C組比較，D組Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(P ＜0.05);D、E、F組Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)差異顯著(P＜0.05)，說明梓醇可通過激活Nrf2/ARE/HO-1信號(hào)通路增強(qiáng)組織抗氧化能力，見圖4、5。

Figure 4.The expression of Nrf2 protein in thoracic aorta tissue in each group.Mean ± SD.n=3.#P ＜ 0.05 vs A group;*P ＜ 0.05 vs B group;△P ＜ 0.05 vs E group;▲P ＜0.05 vs C group.圖4 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織Nrf2蛋白表達(dá)

Figure 5.The expression of HO-1 protein in thoracic aorta tissue of each group.Mean ± SD.n=3.#P ＜0.05 vs A group;*P ＜0.05 vs B group;△P ＜0.05 vs E group;▲P ＜0.05 vs C group.圖5 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織HO-1蛋白表達(dá)

5 梓醇對GK大鼠主動(dòng)脈組織的形態(tài)學(xué)影響

光鏡下觀察到A組大鼠胸主動(dòng)壁層次清晰，內(nèi)膜光滑，細(xì)胞排列規(guī)整;B組可見內(nèi)膜明顯增厚，大量泡沫細(xì)胞堆積;C、D、E組內(nèi)膜增生明顯減輕，尤其以C組最為明顯，說明梓醇能夠保護(hù)GK大鼠主動(dòng)脈，見圖6。

Figure 6.Thoracic aorta tissue HE staining(×400).圖6 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織HE染色

6 梓醇對GK大鼠主動(dòng)脈組織超微結(jié)構(gòu)的影響

電鏡觀察發(fā)現(xiàn)A組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)均正常;B組明顯可見空泡大量堆積，細(xì)胞損傷明顯;C、D、E組損傷明顯減輕，尤其以C組最為明顯，說明梓醇能夠改善GK大鼠主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)的改變，見圖7。

Figure 7.Ultrastructure of aortic endothelial cells under electron microscope(×2 000).圖7 各組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

討 論

大血管病變是糖尿病患者最常見慢性并發(fā)癥之一，80%糖尿病患者死于大血管病變。研究表明，高血糖、高血脂及氧化應(yīng)激等諸多因素均參與了糖尿病大血管病變的發(fā)生發(fā)展［10］。因此，調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂、減輕或阻斷氧化應(yīng)激是防治糖尿病大血管病變的重要途徑。地黃在糖尿病治療方面具有悠久的歷史，是治療糖尿病最常用的中藥之一，梓醇是其主要活性成分，具有降低血糖、保護(hù)神經(jīng)等多種藥理學(xué)作用。但梓醇對糖尿病大血管病變是否具有保護(hù)作用國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究通過給GK大鼠喂食高脂飲食并在飲水中添加L-NAME，成功復(fù)制了糖尿病大血管病變模型［9］。糖尿病大血管病變是血管炎癥和氧化應(yīng)激導(dǎo)致的［11］，研究［12］證實(shí)長期應(yīng)用 LNAME可以誘導(dǎo)早期的血管炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化，本實(shí)驗(yàn)GK大鼠經(jīng)高脂飲食聯(lián)合飲水?dāng)z入L-NAME 12周，B組大鼠胸主動(dòng)脈出現(xiàn)糖尿病大血管病變典型特征，符合實(shí)驗(yàn)要求。給予梓醇干預(yù)治療，病理學(xué)檢測顯示，GK大鼠胸主動(dòng)脈病變明顯減輕，胸主動(dòng)脈組織超微結(jié)構(gòu)損傷明顯得到改善，表明梓醇能夠減輕2型糖尿病大血管病變，對2型糖尿病主動(dòng)脈具有保護(hù)作用。

陳立等［13］發(fā)現(xiàn)，梓醇能調(diào)節(jié)3T3-L1脂肪細(xì)胞糖脂代謝。趙素容等［14］發(fā)現(xiàn)，梓醇能顯著降低糖尿病大鼠血糖，調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂。本研究也發(fā)現(xiàn)梓醇能夠顯著降低GK大鼠血糖及糖化血紅蛋白，改善血脂代謝紊亂，提示梓醇能夠降低血糖、調(diào)節(jié)血脂。

Brownlee［15］曾提出了“糖尿病并發(fā)癥的統(tǒng)一機(jī)制”學(xué)說，并指出氧化應(yīng)激是糖尿病并發(fā)癥的共同基礎(chǔ)。在糖尿病機(jī)體內(nèi)，ROS過量產(chǎn)生，抗氧化酶表達(dá)不足，氧化/抗氧化系統(tǒng)失調(diào)，ROS不能被及時(shí)清除而大量蓄積，從而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成各系統(tǒng)組織細(xì)胞損傷［16-17］。眾所周知，ROS和MDA是衡量機(jī)體氧化應(yīng)激水平的主要指標(biāo)，SOD和T-AOC則是反映機(jī)體抗氧化能力的常用指標(biāo)，因此綜合上述指標(biāo)可以基本判定機(jī)體氧化應(yīng)激水平。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病血管病變模型組大鼠血清ROS和MDA水平明顯增高，而SOD活性和T-AOC明顯降低，說明氧化應(yīng)激促進(jìn)了糖尿病血管病變的發(fā)生。Wang等［18］研究發(fā)現(xiàn)梓醇能夠減輕糖尿病大鼠氧化應(yīng)激水平。本研究也發(fā)現(xiàn)經(jīng)梓醇治療后糖尿病大鼠血清ROS和MDA水平顯著降低，而SOD活性和T-AOC明顯升高，說明梓醇能夠降低糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平。

Nrf2是機(jī)體氧化應(yīng)激的感受器，在細(xì)胞抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，活化的Nrf2與ARE的特異識(shí)別位點(diǎn)相結(jié)合，上調(diào)下游靶分子SOD、HO-1、γ-GCS等抗氧化酶的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)［19-20］。本研究發(fā)現(xiàn)，GK大鼠Nrf2蛋白表達(dá)明顯降低并伴有靶分子HO-1表達(dá)下調(diào)，經(jīng)梓醇治療后Nrf2蛋白表達(dá)明顯增多并伴有靶分子HO-1表達(dá)上調(diào)，表明梓醇可激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，增強(qiáng)抗氧化酶HO-1表達(dá)，從而抑制糖尿病氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)梓醇可以減輕糖尿病大血管病變，對糖尿病大血管具有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用與梓醇改善糖尿病糖脂代謝紊亂、激活Nrf2/ARE/HO-1信號(hào)通路、減輕糖尿病大血管氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

［1］ Lee YA，Cho EJ，Yokozama T.Effects of proanthocyanidin preparations on hyperlipidemia and other biomarkers in mouse model of type 2 diabetes［J］.J Agric Food Chem，2008，56(17):7781-7789.

［2］ 董 炤，陳長勛.梓醇藥理作用的研究進(jìn)展［J］.中成藥，2013，35(5):1047-1051.

［3］ Huang WJ，Niu HS，Lin MH.Antihyperglycemic effect of catalpol in streptozotocin-induced diabetic rats［J］.J Nat Prod，2010，73(6):1170-1172.

［4］ García C，León LG，Pungitore CR，et al.Enhancemet of antiproliferative activity by molecular simplification of catalpol［J］.Bioorg Med Chem，2010，18(7):2515-2523.

［5］ Xu G，Xiong Z，Yong Y，et al.Catalpol attenuates MPTP induced neuronal degeneration of nigral-striatal dopaminergic pathway in mice through elevating glial cell derived neurotrophic factor in striatum［J］.Neuroscience，2010，167(1):174-184.

［6］ Zhang YW，Shi J，Li YJ，et al.Cardiomyocyte deaty in doxorubicin-induced cardiotoxicity［J］.Arch Immunol Ther Exp，2009，57(6):435-445.

［7］ 陳 萍，王國賢，魏慧芳.梓醇對大鼠阿霉素心肌損傷的保護(hù)作用及其抗氧化機(jī)制研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21(7):1650-1651.

［8］ Hu L，Sun Y，Hu J.Catalpol inhibits apoptosis in hydrogen peroxide-induced endothelium by activating the PI3K/Akt signaling pathway and modulating expression of Bcl-2 and Bax［J］.Eur J Pharmacol，2010，628(1-3):155-163.

［9］ 張 琨，謝春光.參芪復(fù)方對GK大鼠2型糖尿病大血管病變氧化應(yīng)激的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27(4):1084-1088.

［10］ Aronson D.Hyperglycemia and the pathobiology of diabetic complications［J］.Adv Cardiol，2008，45:1-16.

［11］徐 雷，馮 波，王 華，等.抗氧化劑α-硫辛酸對2型糖尿病大鼠動(dòng)脈組織NF-κB表達(dá)的影響［J］.中國病理生理雜志，2007，23(12):2474-2475.

［12］ Kataoka C，Egashira K，Inoue S，et al.Important role of Rho-kinase in the pathogenesis of cardiovascular inflammation and remodeling induced by long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats［J］.Hypertension，2002，39(2):245-250.

［13］陳 立，程 瑾，楊明煒，等.梓醇對3T3-L1脂肪細(xì)胞糖脂代謝的影響及其機(jī)制研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2013，24(2):111-114.

［14］趙素容，盧兗偉，陳金龍，等.地黃梓醇降糖作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20(1):171-172.

［15］ Brownlee M.The pathophysiology of diabetic complications:a unifying mechanism［J］.Diabetes，2005，54(6):1615-1625.

［16］ Noh H，Ha H.Reactive oxygen species and oxidative stress［J］.Contrib Nephrol，2011，170:102-112.

［17］柴大軍，寧若冰，祝 江，等.阿托伐他汀通過抑制PKC的激活對抗高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)［J］.中國病理生理雜志，2012，28(9):1537-1542.

［18］ Wang CF，Li DQ，Xue HY，et al.Oral supplementation of catalpol ameliorates diabetic encephalopathy in rats［J］.Brain Res，2010，1307:158-165.

［19］ Min KJ，Lee JT，Joe EH，et al.An IκBα phosphorylation inhibitor induces heme oxygenase-1(HO-1)expression through the activation of reactive oxygen species(ROS)-Nrf2-ARE signaling and ROS-PI3K/Akt signaling in an NF-κB-independent mechanism［J］.Cell Signal，2011，23(9):1505-1513.

［20］林曉萍，李 雯，沈華浩.抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子-Nrf2的研究進(jìn)展［J］.中國病理生理雜志，2011，27(6):1234-1239.