張文峰， 賈 筠， 吳鳳麟， 沈 晗， 邵紅偉△，黃樹林△

存活蛋白(survivin)作為凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的成員，在多數(shù)人類腫瘤細胞中高表達，因在抑制細胞凋亡與調控細胞分裂中起著重要作用而被廣泛研究［1-2］。近些年陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了 survivin-2α、survivin-2B、survivin-ΔEx3 和 survivin-3B等剪接變異體［3-4］。與 survivin類似，sur-vivin-2B剪接變異體也含有4個外顯子，只是在其中一個外顯子中插入了一段69 bp的序列，它們蛋白序列僅為23個氨基酸的差異。研究表明survivin-2B具有誘導細胞凋亡的功能，僅在人類正常組織細胞中表達［5］。一段23個氨基酸的差異導致具有與survivin截然相反的功能，這已成為目前大家關注的焦點，但是具體分子機制尚不明確。本研究在人乳腺癌細胞株MCF7中過表達survivin-2B，誘導出現(xiàn)細胞凋亡與細胞周期阻滯，然后利用一種基于多重聚合酶鏈反應(multiplexpolymerasechain reaction，mPCR)的GeXP多基因遺傳表達分析系統(tǒng)，分析21個腫瘤相關基因的表達變化情況，初步探討survivin-2B誘導細胞凋亡的可能途徑，為進一步研究survivin-2B的功能奠定基礎。

材料和方法

1 材料和試劑

真核表達載體 pcDNA3.1載體、RNA提取的TRIzol試劑、脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000和細胞粉末培養(yǎng)基DMEM均購自Invitrogen;反轉錄試劑盒均購自TaKaRa;Taq聚合酶購自Thermo Fisher;293細胞(人胚腎上皮細胞)和MCF7細胞株由本實驗室保存;Human Breast CancerPlex Kit購自Beckman。

Nanodrop 2000紫外分光光度計購自 Thermo，PCR儀為Biometra產(chǎn)品，GeXP系統(tǒng)及相關耗材均購自Beckman，臺式離心機為 Thermo Fisher Scientific產(chǎn)品，流式細胞儀購自Beckman。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中用DMEM完全培養(yǎng)液(補加10%新生牛血清和2 mol/L谷氨酸)培養(yǎng)MCF7細胞。

2.2 細胞轉染 按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行脂質體包裹質粒轉染MCF7細胞。

2.3 重組載體pcDNA3.1-survivin-2B的構建 Survivin-2B基因僅在人的正常細胞中表達，選取人的腎上皮細胞系293細胞，提取其總RNA進行反轉錄合成cDNA，以該cDNA為模板，PCR擴增survivin-2B片段，上游引物 5’-CCGGAATTCACCATGGGTGCCCCGACGTTG-3’，下游引物 5’-CCGCTCGAGTCAATCCATGGCAGCCAGC-3’。設計引物時，兩端加EcoR I和Xho I酶切位點(見引物的下劃線部分)。擴增條件:95 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)。反應結束后，擴增產(chǎn)物于1.2%agarose凝膠電泳。擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒提純后，經(jīng)EcoR I和 Xho I限制性內切酶酶切，與經(jīng)EcoR I和Xho I酶切后的真核表達載體pcDNA3.1連接;轉化DH5α感受態(tài)細胞，氨芐抗性篩選陽性克隆;擴大培養(yǎng)陽性克隆，經(jīng)菌落PCR初步驗證后，將候選重組載體送Invitrogen測序進一步驗證直至重組表達載體pcDNA3.1-survivin-2B構建成功。

2.4 細胞凋亡的檢測 將空載體pcDNA3.1及重組載體pcDNA3.1-survivin-2B轉染48 h后的細胞用細胞刮小心刮下，800×g離心10 min，棄上清;PBS洗1次，800×g離心10 min棄上清;加2 mL結合緩沖液重懸細胞，800×g離心 10 min棄上清;加100 μL結合緩沖液重懸細胞，隨后加入5 μL annexin V-PE，室溫避光孵育15 min;加入2 mL結合緩沖液重懸細胞，800×g，離心 10 min棄上清;加500 μL結合緩沖液重懸細胞，隨后加入5 μL 7-AAD，上流式細胞儀檢測。

2.5 細胞周期的測定 胰酶適度消化細胞，用培養(yǎng)液吹打，800×g離心 10 min去上清;PBS洗1次，800×g離心10 min棄上清;加0.5 mL PBS吹勻;用5 mL注射器將細胞吸起，用力打入5 mL 70% 預冷乙醇中，4℃固定過夜;800×g離心15 min收集固定細胞，PBS洗2次;用0.4 mL PBS重懸細胞并轉至試管中輕輕吹打;加RNase-A約3 μL至終濃度約為50 mg/L，37 ℃水浴消化30 min;加 PI約50 μL至終濃度約為65 mg/L，在冰浴中避光染色30 min;經(jīng)尼龍網(wǎng)過濾，上流式細胞儀檢測。

2.6 總RNA提取及第1鏈cDNA的合成 用DEPC處理的PBS將培養(yǎng)細胞洗2遍，總RNA提取按照Invitrogen試劑盒提供的方法進行，總RNA經(jīng)濃度測定后，分別取 320 ng、160 ng、80 ng、40 ng、20 ng、10 ng、5 ng、2.5 ng和1.25 ng總 RNA，按照 PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書進行第1鏈cDNA合成，引物為貝克曼公司Human Breast Cancer-Plex Kit提供的有關25個基因特異性引物混合物。條件為:65℃ 5 min，50℃ 60 min，95℃ 5 min。

2.7 標準曲線的繪制 選取貝克曼庫爾特公司Human Breast CancerPlex Kit，該試劑盒包含25個基因，其中3個為內參照基因，1個為內質控基因，21個腫瘤相關基因(見表1)。提取細胞總RNA并經(jīng)紫外分光光度計定量，分別取 320 ng、160 ng、80 ng、40 ng、20 ng、10 ng、5 ng、2.5 ng 和 1.25 ng 總RNA，反轉錄cDNA后，通用引物(上游加熒光標記FAM)和特異性嵌合引物(5′末端連接通用引物序列)按一定比例分別加入，先由正、反向嵌合引物的特異性序列結合到cDNA模板啟動PCR反應，經(jīng)過數(shù)個循環(huán)后，分別擴增出上、下游通用引物的互補序列;最后再以此為模板，由通用引物主導，與其互補序列結合來進行擴增反應。本實驗在一個體系同時進行25重PCR反應，每個目的基因PCR產(chǎn)物長度大小的差異可經(jīng)毛細管電泳區(qū)分，其熒光的強度反映目的基因mRNA模板量。按照PrimeSTAR HS試劑盒說明書配制9管25 μL反應體系，每管多重體系反應包括:5 ×PrimeSTAR Buffer 5 μL，dNTP Mixture(各 2.5 mmol/L)2 μL，DNA polymerase(2.5 ×106U/L)0.25 μL，上、下游嵌合引物(各引物均為0.5 μmol/L)各取 1 μL，使反應體系 終 濃度為20 nmol/L，上游FAM標記熒光通用引物和下游通用引物(10 μmol/L)各取 2 μL，使反應體系終濃度800 nmol/L，模板 cDNA 1 μL，用不含核酸酶的水補至25 μL。對反應條件進行優(yōu)化，最終確定反應條件為:98 ℃ 4 min，98 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)，72℃ 10 min。擴增完成后取0.5 μL擴增產(chǎn)物，利用GeXP多基因表達分析系統(tǒng)檢測每個基因的標準化熒光比值。

表1 目的基因的介紹Table 1.Introduction of the interest genes

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用獨立t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 重組載體pcDNA3.1-survivin-2B的構建及表達

Survivin-2B基因編碼區(qū)長度為468個堿基，加上2條引物各自攜帶的12個堿基的酶切位點及保護堿基序列，擴增產(chǎn)物理論長度為492個堿基。PCR擴增survivin-2B基因片段的結果見圖1A，在大約500 bp處獲得條帶，與預期大小相符合。將測序正確的重組表達載體pcDNA3.1-survivin-2B及空載體pcDNA3.1經(jīng)脂質體轉染MCF7細胞48 h后，提取MCF7細胞總RNA，以oligo(dT)為引物反轉錄合成cDNA;以該cDNA為模板，以survivin-2B基因特異性引物進行擴增驗證，擴增產(chǎn)物于1.2%agarose凝膠電泳(圖1B)，僅在轉染pcDNA3.1-survivin-2B重組質粒細胞中獲得單一目的條帶，而轉染pcDNA3.1空載體的MCF7細胞中沒有出現(xiàn)目的條帶，表明survivin-2B基因在MCF7細胞中未發(fā)現(xiàn)本底表達，重組載體pcDNA3.1-survivin-2B轉染MCF7細胞后，survivin-2B基因有效表達。

2 Survivin-2B引起腫瘤細胞凋亡與細胞周期阻滯

轉染48 h后，相比于空載體pcDNA3.1轉染對照組，survivin-2B轉染組早期凋亡細胞比例顯著增加(2.7%上升至10.3%)，晚期凋亡細胞比例也有所提高(1.3%上升至10.4%)，凋亡細胞比例顯著增加(4.0%上升至20.7%)，表明survivin-2B誘導細胞凋亡(圖2)。相比于空載體pcDNA3.1轉染對照組，survivin-2B轉染組細胞周期中G2/M期的細胞比例明顯增加(6.4%上升至22.4%)，而G1期和S期的細胞比例未見顯著變化，表明過表達survivin-2B基因能夠引起細胞周期阻滯于G2/M期，見圖3。

Figure 1. Construction of recombinant eukaryotic expression plasmid expressing survivin-2B(A)and its expression in MCF7 cells(B).M:DNA marker DL2000;1:survivin-2B gene;2:negative control.圖1 重組載體pcDNA3.1-survivin-2B的構建及在MCF7細胞中的表達

3 標準曲線繪制

不同起始模板條件下，25個目的基因擴增后均有對應的標準化熒光比值，根據(jù)此數(shù)值繪制25個目的基因擴增的標準曲線，見表2。

Figure 2.The apoptosis of MCF-7 cells was detected by flow cytometry after the gene transfection.A:MCF-7 cells;B:MCF-7 cells transfected with pcDNA3.1;C:MCF-7 cells transfected with pcDNA3.1-survivin-2B.圖2 基因轉染后的細胞凋亡的流式細胞術分析結果

Figure 3.The cell cycle of MCF-7 cells transfected with survivin-2B.A:MCF-7 cells;B:MCF-7 cells transfected with pcDNA3.1;C:MCF-7 cells transfected with pcDNA3.1-survivin-2B.圖3 基因轉染后細胞周期的流式細胞術分析結果

表2 不同總RNA量條件下目的基因擴增后的標準化熒光比值Table 2.Normalized values of interest genes with different amounts of total RNA

4 腫瘤相關基因表達變化情況

總共有10個基因的表達差異有統(tǒng)計學意義，其中表達下調8個，表達上調2個;這10個基因在對照組與轉染survivin-2B實驗組中的標準化熒光比值均位于所對應標準曲線的檢測范圍內;表達變化最大的為醛脫氫酶4家族成員A1(aldehyde dehydrogenase 4 family member A1，ALDH4A1)，表達下降48%;變化最小的為胞質分裂調控蛋白1(protein regulator of cytokinesis 1，PRC1)，表達上調 1.08倍，見圖4。

以往研究發(fā)現(xiàn)，EGLN1的缺失會抑制細胞內轉化生長因子 β(transforming growth factor β，TGF-β)的表達以及 TGF-β蛋白的胞內加工［6］;TGF-β能夠誘導腫瘤細胞中醛脫氫酶1(aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1)的表達上調，同時ALDH1的表達與抑制因子Bcl-2的表達呈正相關［7-8］。綜合本研究結果，我們推測survivin-2B誘導細胞凋亡的可能途徑為survivin-2B下調EGLN1的表達，EGLN1表達下降后導致TGF-β表達下調，然后導致ALDH1表達受到抑制，從而導致Bcl-2表達下降而誘導細胞凋亡，其有關該信號通路的細節(jié)有待進一步實驗驗證。

Figure 4.The changes of gene expression in the MCF-7 cells between the 2 groups.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01.圖4 轉染前后基因表達的變化

討 論

基因表達分析的常用方法包括熒光定量PCR與Northern雜交。熒光定量PCR因操作簡單、高靈敏度、實時檢測等優(yōu)點在基因表達分析中使用更廣泛，但每個反應只能檢測單個基因的缺點限制其在大樣本量、多基因檢測中的應用［9-10］。多基因表達分析系統(tǒng)是一種全新的基因表達譜定量分析平臺，它采用特異性引物和熒光標記通用引物共用的方法，既保證高特異性擴增又能有效克服傳統(tǒng)PCR因產(chǎn)物和引物差異導致的擴增效率不等引起的結果偏差，從而實現(xiàn)多重產(chǎn)物定量檢測的目的［11-12］。

目前有關survivin-2B促細胞凋亡的分子機制并不清楚，本文利用survivin-2B在乳腺癌細胞株中過表達，成功誘導細胞凋亡以及細胞周期阻滯于G2/M期;同時利用多重PCR反應和熒光定量分析結合的方法，檢測21個腫瘤相關基因的表達變化情況，其中8個基因表達下調，2個基因表達上調。這些基因編碼的蛋白大多為參與細胞周期的調控蛋白以及胞內關鍵信號通路的節(jié)點蛋白，這些基因表達的變化與引起細胞凋亡、細胞周期阻滯有著密切關系。

以往研究結果表明，survivin-2B能夠抑制細胞有絲分裂，誘導線粒體介導的細胞凋亡，并且上調促凋亡因子Bax的表達，下調凋亡抑制因子Bcl-2的表達［13］，有關 survivin-2B下調 Bcl-2表達的具體機制并不清楚。根據(jù)GeXP多基因表達分析系統(tǒng)檢測基因表達變化的結果，我們提出了關于survivin-2B下調Bcl-2表達的一個可能分子途徑(見結果部分)。對于survivin-2B抑制EGLN1表達的具體分子機制有待深入研究，我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)survivin-2B與survivin-ΔEx3在細胞質中存在較弱的相互作用［14］，推測 survivin-2B 與 survivin-ΔEx3 可能通過相互結合形成某種蛋白復合體而抑制轉錄因子與EGLN1基因啟動子的有效結合，從而導致EGLN1的表達下調。在細胞有絲分裂的DNA復制過程中，DNA聚合酶催化DNA鏈的延伸過程需要復制因子C(replication factor C，RFC)的參與［15］，本研究發(fā)現(xiàn)survivin-2B誘導RFC的表達下調，導致DNA復制過程受到抑制，我們推測其也許與survivin-2B抑制細胞有絲分裂及誘導細胞周期阻滯有關，其具體機制有待研究。總之，本研究為survivin-2B誘導腫瘤細胞周期阻滯與細胞凋亡的分子機制研究提供了有益參考，為進一步研究survivin-2B的功能奠定了基礎。

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