賀延新，劉素玲

(廣東省深圳市平樂(lè)骨傷科醫(yī)院，廣東 深圳 518000)

普盧利沙星(NM441)是噻丁啶－喹啉羧酸衍生物(NM394)的脂溶性前體藥物，口服易吸收并水解成NM394，NM394選擇性分布于菌體內(nèi)，抑制細(xì)菌DNA螺旋酶的活性，從而發(fā)揮廣譜抗菌作用，但NM394口服吸收較差[1]。NM394作為NM441的合成母體及降解產(chǎn)物，因此有必要控制產(chǎn)品中NM394的量，以保證普盧利沙星產(chǎn)品的質(zhì)量。本試驗(yàn)中采用反相高效液相色譜(RP－HPLC)流動(dòng)相梯度洗脫法測(cè)定普盧利沙星中NM394含量及其他有關(guān)物質(zhì)。

1 儀器與試藥

日本島津LC－2010AHT型高效液相色譜儀;FA2004型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);CSB6L－1800型超聲波清洗器(天津考德斯科技有限公司);AD－DI30(UV)型超純水系統(tǒng)(上海訊輝環(huán)保科技有限公司)。普盧利沙星對(duì)照品(純度為99．4%)、NM394對(duì)照品(天津市漢康醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司，含量為99．6%);普盧利沙星片(批號(hào)為 090720，090721，090722，廣州白云山制藥股份有限公司)，規(guī)格為100 mg普盧利沙星相當(dāng)于NM394 100 mg;乙腈、三乙胺為色譜純，水為超純水，磷酸二氫鈉為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱:Phenomenex C18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm);流動(dòng)相:A為0．025 mol/L磷酸二氫鈉溶液(用三乙胺調(diào)pH至6．0)，B為乙腈，用流動(dòng)相A－B(80∶20)洗脫至NM394的峰完全檢出約6 min，即換流動(dòng)相A－B(60∶40)洗脫至普盧利沙星峰保留時(shí)間的 3 倍;流速:1．0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):276 nm;進(jìn)樣量:20 μL。

2．2 溶液制備

取本品20片，研細(xì)，精密稱(chēng)取適量(約相當(dāng)于普盧利沙星50 mg)，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相B 50 mL，超聲處理5 min使溶解，加流動(dòng)相A－B(60∶40)稀釋至刻度，搖勻、過(guò)濾，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相A－B(60∶40)稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。取NM394對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，用流動(dòng)相A－B(80∶20)溶解并稀釋成每1 mL中約含2 μg的溶液，作為NM394對(duì)照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

輔料干擾試驗(yàn):取處方量的輔料適量，置100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相A－B(60∶40)溶解并稀釋至刻度，濾過(guò)，量取續(xù)濾液，作為陰性對(duì)照溶液，依法進(jìn)樣20 μL。結(jié)果見(jiàn)圖1A。

NM394與普盧利沙星對(duì)照試驗(yàn):取NM394、普盧利沙星對(duì)照品各適量，置100 mL容量瓶中，按2．2項(xiàng)下方法配制NM394對(duì)照溶液、陽(yáng)性對(duì)照品溶液。取普盧利沙星片0．12 g，依法制成供試品溶液。取以上各溶液，依法進(jìn)樣20 μL。結(jié)果見(jiàn)圖1B和圖1C。

破壞試驗(yàn):稱(chēng)取本品細(xì)粉約0．12 g共3份，分別置100 mL容量瓶中，加入0．5 mol/L鹽酸溶液1 mL，放置1 h后依法測(cè)定(酸破壞);加入0．1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL，放置1 h后依法測(cè)定(堿破壞);加入(1→10)雙氧水1 mL，放置10 min后依法測(cè)定(氧化破壞)。取本品適量，在(4 500±500)lx下光照10 d后，研細(xì)，取細(xì)粉約0．12 g，置100 mL容量瓶中，依法測(cè)定(強(qiáng)光破壞)。取本品適量，在105℃放置8 h后，研細(xì)，取細(xì)粉約0．12 g，置100 mL容量瓶中，依法測(cè)定(熱破壞)。破壞試驗(yàn)色譜圖見(jiàn)圖2。

線(xiàn)性關(guān)系考察:精密稱(chēng)取NM394對(duì)照品適量，用流動(dòng)相AB(80 ∶20)溶解，配成 0．24 g/L 的溶液，分別精密吸取 0．5，1．0，2．0，4．0，8．0，12．0 mL，置 100 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相 A － B(80∶20)稀釋至刻度，搖勻。按測(cè)定方法進(jìn)樣20 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，回歸方程為 Y=4 450．4 X －5．220 7，r=0．999 1(n=6)。結(jié)果表明，NM394 質(zhì)量濃度在1．2～28．8 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

圖1 輔料干擾與對(duì)照試驗(yàn)色譜圖

圖2 破壞試驗(yàn)色譜圖

最低檢測(cè)限確定:精密稱(chēng)取NM394和普盧利沙星對(duì)照品適量，分別用流動(dòng)相A－B(80∶20)和流動(dòng)相A－B(60∶40)溶解配制成 0．43 μg/mL 和 0．22 μg/mL 的溶液，進(jìn)樣 20 μL，觀察主成分峰高度。當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，計(jì)算得NM394、普盧利沙星最低檢測(cè)限量分別為 6．3 μg 和 2．8 μg。

溶液穩(wěn)定性試驗(yàn):取2．2項(xiàng)下供試品溶液，分別放置0，2，4，6，8 h后，取樣測(cè)定NM394及其他雜質(zhì)含量。結(jié)果表明，NM394及其他雜質(zhì)含量與初始溶液相比無(wú)明顯變化，沒(méi)有降解產(chǎn)物出現(xiàn)，供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD分別為1．7%和0．8%。

NM394回收率試驗(yàn):取處方量本品輔料約0．11 g，共9份，分別置100 mL容量瓶中。取NM394對(duì)照品約20 mg，置500 mL容量瓶中，加流動(dòng)相A－B(80∶20)溶解并稀釋至刻度，搖勻;分別精密吸取4，5，6 mL各3份，分別加入9個(gè)輔料溶液容量瓶中，用流動(dòng)相A－B(60∶40)溶解稀釋至刻度，制成80%，100%，120%濃度的供試品溶液;量取20 μL，依法進(jìn)樣。結(jié)果低、中、高濃度回收 率 分 別 為 98．8% ，99．7% ，99．4% ，RSD 分 別 為 0．99% ，0．61% ，0．43% 。

供試品溶液濃度與有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果相關(guān)性考察:稱(chēng)取本品細(xì)粉適量，精密稱(chēng)定，共3份(各約相當(dāng)于普盧利沙星25，50，100mg)，分別置100 mL容量瓶中，依法測(cè)定。結(jié)果有關(guān)物質(zhì)分別為0．34% ，0．36% ，0．35% ，RSD 為 2．8% 。溶液 的質(zhì)量濃 度在0．25～1．0 g/L間與有關(guān)物質(zhì)的含量有良好的相關(guān)性。

重復(fù)性試驗(yàn):稱(chēng)取本品細(xì)粉約0．12 g，精密稱(chēng)定，共6份，依法測(cè)定。結(jié)果NM394含量的 RSD為0．89%，表明方法重復(fù)性良好。

2．4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，依法測(cè)定。結(jié)果3批樣品中NM394含量分別為0．05% ，0．04% ，0．08% ，有 關(guān) 物 質(zhì) 含 量 為 0．36% ，0．37% ，0．37%，表明NM394及有關(guān)物質(zhì)均在限度內(nèi)。

3 討論

普盧利沙星為脂溶性化學(xué)物質(zhì)，在流動(dòng)相中極易降解生成水溶性的NM394[3];因此溶解NM394的溶劑選流動(dòng)相A－B(80∶20)，溶解樣品的溶劑選流動(dòng)相A－B(60∶40)。二者所選的溶劑目前雖無(wú)法統(tǒng)一，采用2種溶劑，但可以保證樣品測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定。

由色譜圖(圖1及圖2)可知，輔料無(wú)吸收峰，因此輔料對(duì)NM394及其他有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定無(wú)干擾;本品經(jīng)酸、堿、氧化、強(qiáng)光、高溫條件的破壞試驗(yàn)后，產(chǎn)生的雜質(zhì)峰與主成分峰、NM394峰在本色譜條件下能夠有效分離，分離度符合要求。因此，該色譜系統(tǒng)測(cè)定本品中NM394及其有關(guān)物質(zhì)的專(zhuān)屬性較強(qiáng)，可采用梯度洗脫法測(cè)定NM394及其他有關(guān)物質(zhì)。

在普盧利沙星的測(cè)定色譜條件下，NM394成分的保留時(shí)間較短(幾乎無(wú)保留)，容易被系統(tǒng)產(chǎn)生的色譜峰干擾，所測(cè)NM394結(jié)果不穩(wěn)定[2]。采用流動(dòng)相梯度洗脫，NM394保留時(shí)間延長(zhǎng);主成分峰、NM394峰及其他各雜質(zhì)峰均能有效分離，且分離度良好、專(zhuān)屬性較強(qiáng)、準(zhǔn)確度高。因此，本色譜系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確測(cè)定普盧利沙星中的NM394和有關(guān)物質(zhì)。

[1]Ozaki M，Matsuda M，Tomii Y，et al．In vivo evaluation of NM441，a new thiazeto －quinoline derivative[J]．Antimicrob Agents Chemother，1991，35(12):2 496－2 499．

[2]初 虹．HPLC法檢查普盧利沙星有關(guān)物質(zhì)[J]．藥學(xué)進(jìn)展，2004，28(9):424－427．

[3]程秀民，馬淑濤，塵學(xué)蘭，等．普盧利沙星的HPLC測(cè)定[J]．中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2004，35(11):682 －683．