楊 霞 葉金云 周志金 張易祥 吳成龍 明建華

(1. 湖州師范學院生命科學學院, 浙江省水生生物資源養(yǎng)護與開發(fā)技術研究重點實驗室, 湖州 313000;2. 湖州市水產技術推廣站, 湖州 313000)

亮氨酸(Leu)和異亮氨酸(Ile)是水產動物體內不能合成而必須從飼糧中獲取的氨基酸, 即必需氨基酸(EAA), 都屬于脂肪族氨基酸, 同時也都是支鏈氨基酸(BCAA)。它們特殊的結構和功能在生命代謝中占有特別重要的地位。亮氨酸是BCAA中唯一的生酮氨基酸, 刺激胰島細胞釋放胰島素[1,2], 和纈氨酸、異亮氨酸一起可以起到保護肌肉的作用。亮氨酸的主要氧化部位在肌肉, 是合成機體蛋白質的原料, 可以抑制蛋白降解和促進肌肉蛋白合成[3—5];對血紅蛋白合成和維持血糖水平以及激素的增加有重要作用; 亮氨酸的缺乏可能引起嚴重的缺乏癥狀如生長的阻滯[6,7]。而異亮氨酸是合成動物體激素和酶類的原料, 具有促進蛋白質合成和抑制其分解的作用。目前, 國內外學者已經開展了一些水產動物對 Leu和 Ile營養(yǎng)需求的研究, 確定了虱目魚(Chanos chanos Forsskal)[8]、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)[9]、印度鯪(Cirrhinus mrigala)[10]、草魚(Cenopharyngodon idellus)[11]、建鯉(Cyprinus carpio var.Jian)[12]、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[13]等多種魚蝦的亮氨酸和異亮氨酸需求量。

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis), 俗稱河蟹、大閘蟹, 屬節(jié)肢動物門甲殼綱, 是我國特有的淡水珍品。目前, 關于中華絨螯蟹對氨基酸需求的研究僅限于賴氨酸、蛋氨酸和精氨酸[14,15]。本試驗以中華絨螯蟹幼蟹為研究對象, 以幼蟹的生長性能及肌肉必需氨基酸含量等為評價指標, 研究飼料中不同水平的Leu或 Ile對中華絨螯蟹生長的影響, 旨在獲得中華絨螯蟹幼蟹對Leu和Ile的需要量, 以期完善中華絨螯蟹對十種必需氨基酸需要量的數(shù)據(jù)庫, 為研制中華絨螯蟹營養(yǎng)平衡的人工配合飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗用蟹

試驗蟹苗購自上海市崇明島長江口中華絨螯蟹養(yǎng)殖基地, 采用經過沉淀、過濾后的天然池塘水進行養(yǎng)殖。水泥池中暫養(yǎng)一周, 挑取體重均一、附肢完整的幼蟹作為試驗對象。采用底面為長方形(60 cm×85 cm, 水容量 300 L)的白色塑料水箱, 箱內水深約30 cm, 每箱40只幼蟹, 初始體重為(0.90±0.02) g, 水箱內放置足夠數(shù)量的網片及圓形PVC管作為隱蔽物。

1.2 試驗飼料

采用單因子試驗設計方法, 為了使基礎飼料中目標氨基酸(Leu或 Ile)含量盡可能低, 因此分別采用不同的飼料配方, 以酪蛋白、明膠、魚粉為蛋白源, 糊精、玉米淀粉為糖源, 魚油、豆油、卵磷脂為脂肪源制成基礎飼料?；A飼料配方和營養(yǎng)組成見表 1, 氨基酸組成模式參照王樹英和陳輝[16]測定的河蟹肌肉氨基酸含量(表2)。每個試驗分別設6個氨基酸濃度梯度, 每個濃度3重復。飼料中Leu添加梯度為0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%, 實測各組飼料Leu含量為0.87%、1.26%、1.64%、2.03%、2.39%和2.81%; 飼料中Ile添加梯度為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5 %, 實測各組飼料Ile含量為0.69%、1.21%、1.70%、2.19%、2.70%和3.21% (表3)。

在試驗飼料制作時, 先將原料粉碎, 使原料粉末能全部通過60目試驗篩, 再按比例充分混勻后加適量水攪拌, 通過絞肉機擠成直徑 1.5 mm的長條,風干后, 破碎成粒徑為(1—2) mm 的破碎料, 置于4℃冰箱內密封保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎飼料配方及其營養(yǎng)組成Tab. 1 Formulation and nutritional composition of the basal diets (%)

表2 飼料配方中氨基酸混合物組成Tab. 2 Composition of amino acid mixtures in formulation (%)

1.3 飼養(yǎng)管理

采用表觀飽食投喂法, 每天于上午八點和下午五點投喂兩次, 次日吸污并補充養(yǎng)殖用水。此外, 每周定期測定水質情況, 水溫(28—32)℃、溶解氧>5 mg/L、氨氮<0.1mg /L、pH 6.8—7.2, 連續(xù)充氣增氧, 實驗周期60d。

1.4 樣品采集與分析

試驗期間, 河蟹因脫殼或相互殘殺死亡后及時撈出, 并精確稱重, 其增重部分不計入試驗結果。試驗結束后, 停食24h, 撈出全部河蟹, 盡量瀝干水分,稱重。一部分烘干后作全蟹樣品, 用于常規(guī)生化分析; 一部分提取肌肉樣品, 濾紙吸干水分后用于氨基酸含量的測定。測定指標包括水分、粗蛋白質、粗脂肪、灰分以及氨基酸含量, 分別采用105℃恒重法、凱式定氮法、索氏抽提法、550℃馬福爐灼燒法以及氨基酸自動分析儀。

計算公式: 特定生長率(SGR, %/d)＝(Ln結束時平均體重–Ln開始時平均體重) /試驗天數(shù)×100; 成活率(SR, %)=實驗結束后試驗蟹數(shù)目/實驗開始時試驗蟹數(shù)目×100。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準差(Mean±SD)表示,采用 SPSS 20.0軟件包對所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA), 若有顯著差異, 再做Duncan’s多重比較, 檢驗組間差異的顯著性(P<0.05)。

2 結果

2.1 不同氨基酸水平對中華絨螯蟹幼蟹生長性能的影響

飼料亮氨酸水平對中華絨螯蟹幼蟹末均重和特定生長率有顯著影響(P<0.05), 但對成活率影響不顯著(P>0.05) (表4)。河蟹的末均重和特定生長率隨飼料中亮氨酸含量的升高呈先上升后下降的趨勢。當飼料中亮氨酸含量為2.39% (Leu-5組)時, 河蟹幼蟹的末均重和特定生長率均達到最大值, 與 Leu-4和Leu-6組差異不顯著(P>0.05), 但顯著高于Leu-1、Leu-2和 Leu-3組(P<0.05)。

飼料中異亮氨酸水平對中華絨螯蟹幼蟹末均重和特定生長率均有顯著影響(P<0.05), 對成活率影響不顯著(P>0.05) (表5)。幼蟹的末均重和特定生長率隨飼料中異亮氨酸含量的升高呈先上升后下降的趨勢。當飼料中異亮氨酸含量為2.19% (Ile-4組)時,末均重和特定生長率均達到最大值, 顯著高于Ile-1、Ile-2、Ile-3和 Ile-6 組(P<0.05)。

表3 試驗飼料中的氨基酸組成(實測值)Tab. 3 Composition of amino acid in test diets (measured value) (%)

表4 飼料Leu水平對中華絨螯蟹幼蟹生長性能的影響Tab. 4 Effect of dietary leucine levels on growth performance of juvenile E. sinensis

表5 飼料Ile水平對中華絨螯蟹幼蟹生長性能的影響Tab. 5 Effect of dietary isoleucine levels on growth performance of juvenile E. sinensis

2.2 中華絨螯蟹幼蟹對亮氨酸和異亮氨酸的需要量

以氨基酸水平(x)為橫坐標, 特定生長率(y)為縱坐標, 根據(jù)折線模型得出中華絨螯蟹幼蟹飼料中亮氨酸最適需要量為 2.36% (圖 1), 占蛋白含量的5.88%; 飼料中異亮氨酸最適需要量為2.25% (圖2),占蛋白含量的5.72%。

圖1 飼料亮氨酸水平對中華絨螯蟹幼蟹特定生長率的影響Fig. 1 Effect of dietary Leu level on SGR of the crab

圖2 飼料異亮氨酸水平對中華絨螯蟹幼蟹特定生長率的影響Fig. 2 Effect of dietary Ile level on SGR of the crab

2.3 亮氨酸水平對中華絨螯蟹幼蟹體組成的影響

由表 6可知, 飼料中亮氨酸水平對中華絨螯蟹全蟹水分、粗脂肪和灰分沒有顯著影響(P>0.05)。粗蛋白含量隨著飼料中亮氨酸水平的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, 當飼料中亮氨酸含量為 2.39%(Leu-5組)時, 河蟹粗蛋白含量達到最大值12.49%。

2.4 異亮氨酸水平對中華絨螯蟹幼蟹體組成的影響

由表7可知, 飼料中異亮氨酸水平對中華絨螯蟹全蟹水分、粗脂肪和灰分沒有顯著性差異(P>0.05)。粗蛋白含量隨著飼料中異亮氨酸水平的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, 當飼料中異亮氨酸含量為2.19%(Ile-4組)時, 河蟹粗蛋白含量達到最大值12.43%。

2.5 亮氨酸水平對中華絨螯蟹幼蟹肌肉氨基酸組成的影響

由表 8可知, 亮氨酸水平對河蟹肌肉谷氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、脯氨酸以及必需氨基酸總量(∑EAA)、非必需氨基酸總量(∑NEAA)、氨基酸總量(TAA)有顯著性影響(P<0.05), 對其他氨基酸影響不顯著(P>0.05)。當飼料中亮氨酸含量大于2.39% (Leu-5和Leu-6組)時,河蟹肌肉中的Leu含量、必需氨基酸總量和氨基酸總量均顯著高于其他各試驗組(P<0.05)。

2.6 異亮氨酸水平對中華絨螯蟹幼蟹肌肉氨基酸組成的影響

由表9可知, 異亮氨酸水平對河蟹肌肉谷氨酸、纈氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、脯氨酸以及∑EAA、∑NEAA、TAA有顯著影響(P<0.05),對其他氨基酸無顯著影響(P>0.05)。河蟹肌肉中的Ile含量、必需氨基酸總量和氨基酸總量隨飼料中異亮氨酸含量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢, 最大值均出現(xiàn)在 Ile-5組(2.70% Ile), 但 Ile-5組與 Ile-4組(2.19% Ile)差異不顯著(P>0.05)。

表6 飼料Leu水平對中華絨螯蟹幼蟹體組成的影響Tab. 6 Effect of dietary leucine levels on body composition of juvenile E. sinensis (%)

表7 飼料Ile水平對中華絨螯蟹幼蟹體組成的影響Tab. 7 Effect of dietary isoleucine levels on body composition of juvenile E. sinensis (%)

表8 飼料Leu水平對中華絨螯蟹肌肉氨基酸組成的影響Tab. 8 Effect of dietary leucine levels on AA composition in muscles of E. sinensis (%)

表9 飼料Ile水平對中華絨螯蟹肌肉氨基酸組成的影響Tab. 9 Effect of dietary isoleucine levels on amino acid composition in muscles of E. sinensis (%)

3 討論

亮氨酸是甲殼動物的必需氨基酸之一, 與異亮氨酸和纈氨酸被稱為 BCAA。Leu是合成機體蛋白質的原料, 具有許多重要的生物學功能。在本試驗中, 飼料 Leu含量不足時, 河蟹表現(xiàn)出顯著的生長抑制, 隨著飼料中 Leu水平逐漸增加, 河蟹幼蟹的生長性能明顯得到改善。這說明Leu可以為幼蟹的生長提供營養(yǎng), 中華絨螯蟹能夠利用晶體 Leu。以SGR為評價指標, 通過折線模型得到中華絨螯蟹對Leu的需要量為 2.36%的飼料干物質, 即占飼料蛋白的 5.88%。此需要量高于以往報道的甲殼動物對Leu的營養(yǎng)需求(占飼料蛋白百分比), 如斑節(jié)對蝦4.3%[9]、凡納濱對蝦 5.71%[13]、日本對蝦(Marsupenaeus japonicus) 3.4%[17]和南美白對蝦(Penaeus vannamei) 5.45%[18]。與其他水生動物相比, 高于南亞野鯪(Labeo rohita) (3.75—3.92)%[6]、建鯉 3.7%[7]、大西洋鮭(Salmo salar) 5.2%[19]、大菱鲆(Psetta maxima)4.6%[20]、白鱘(Acipenser transmontanus) 4.3%[21]、印度鯪 3.9%[10]、鱸魚(Lateolabrax japonicus) 5.67%[22]等的亮氨酸需要量; 低于虹鱒(Oncorhynchus mykiss)9.2%[23]、團頭魴(Megalobrama amblycephala) 6.98%[24]和大黃魚(Pseudosciaena crocea) 6.79%[25]的研究結果。這說明不同種類的動物對亮氨酸需要量的差異較大, 可能與實驗對象、個體大小、飼養(yǎng)管理、實驗條件以及飼料組成和適口性等有關。另外, 本試驗使用的是晶體氨基酸, 溶出問題也可能會對試驗結果產生影響。這些影響因素有待進一步研究完善。

適宜的Leu水平能夠提高中華絨螯蟹幼蟹生長,隨著飼料中Leu水平的升高, 河蟹幼蟹SGR和全蟹粗蛋白質含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當飼料中Leu的含量為2.39% (Leu-5組)時, SGR和機體粗蛋白含量達最大值, 但 Leu-5組與 Leu-6組的 SGR和機體粗蛋白質含量差異不顯著, 說明過多的 Leu并沒有明顯限制河蟹幼蟹生長, 這與之前的研究結果略有不同[7,13,22], 或者飼料中Leu水平還可以繼續(xù)增加, 說明河蟹幼蟹對Leu的需要量較高。

異亮氨酸屬于脂肪族中性氨基酸, 也是生物體必需氨基酸之一, 與結構類似的亮氨酸、纈氨酸在營養(yǎng)上有相關性, 因其特殊的結構和功能, 在生命代謝中占有特別重要的地位。目前有關甲殼動物對異亮氨酸需要量的研究較少, 只確定了斑節(jié)對蝦[9]和南美白對蝦[13]對Ile的需要量分別為 2.7%和4.33% (占飼料蛋白百分比)。本試驗通過折線回歸模型得到中華絨螯蟹對Ile的需要量為2.25%的飼料干物質, 即占飼料蛋白的5.72%。由此可見不同種類甲殼動物對Ile的需要量存在較大差異。而且, 鑒于相關研究文獻極少, 實驗結果有待進一步證實。

另外, 3種支鏈氨基酸之間的拮抗作用也會影響某種支鏈氨基酸的需求量[26], 但這種拮抗作用在甲殼動物中還未見闡明。在本試驗中, 飼料氨基酸組成模式是參照中華絨螯蟹肌肉氨基酸模式設計而得,使其滿足除實驗氨基酸外其他兩種氨基酸的需求,以期減小因支鏈氨基酸間的拮抗對實驗氨基酸需求量結果的影響。通過檢測中華絨螯蟹肌肉氨基酸的組成, 發(fā)現(xiàn)飼料中亮氨酸或異亮氨酸的含量對肌肉中三種支鏈氨基酸的含量具有顯著影響, 而且與全蟹粗蛋白的變化趨勢極其相似, 均呈先增加后降低的趨勢。但是滿足需求后, 飼料中實驗氨基酸水平對肌肉中三種支鏈氨基酸含量的影響也隨之減小。有報道也認為, 當飼料中其他支鏈氨基酸含量滿足其最低需求時, 其拮抗作用對實驗氨基酸需求量結果的影響較小[27]。此外, 亮氨酸對全蟹蛋白和肌肉TAA測定結果表明, Leu需求滿足后, 繼續(xù)升高飼料Leu水平對蛋白質合成無影響。Garlick研究發(fā)現(xiàn), 高濃度的亮氨酸對除骨骼肌以外的機體組織蛋白質的降解有抑制作用[28]。因此, 當Leu水平升高時并未對蛋白質的合成和降解產生顯著影響。而在異亮氨酸實驗中, 飼料中Ile水平過高(Ile-6)時, 全蟹蛋白和肌肉TAA顯著下降, 說明過量的Ile可能導致蛋白質合成代謝下降, 分解代謝增強, 從而抑制蛋白質沉積及幼蟹生長。

綜上所述, 根據(jù)特定生長率和飼料氨基酸水平進行折線回歸模型, 得到中華絨螯蟹幼蟹對亮氨酸的最適需要量為飼料干物質的 2.36% (占飼料蛋白5.88%), 異亮氨酸的最適需要量為飼料干物質的2.25% (占飼料蛋白5.72%)。