孫海偉 習丙文 謝 駿,

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院, 無錫 210095; 2. 中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心, 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)與種質資源利用重點實驗室, 無錫 214081)

放射孢子蟲(Actinospore)是黏體動物(Myxozoan)生活史中寄生在環(huán)節(jié)動物(Anneild)宿主體內的重要階段。自Stolc[1]在顫蚓(寡毛類)中首次發(fā)現(xiàn)和報道放射孢子蟲以來, 在很長一段時間內放射孢子蟲一直被認為是與黏孢子蟲 (Myxospore) 親緣關系很近的獨立生物類群, 并隸屬于黏體動物門(Myxozoa)放射孢子蟲綱(Actinosporea);同時, 由于該類群未曾發(fā)現(xiàn)嚴重的經(jīng)濟或社會影響, 相關的報道和研究非常稀少。然而, 1984年, Wolf 和Markiw[2]對有關虹鱒“旋轉病”(Whirling disease, WD)病原腦黏體蟲(Myxobolus cerebralis)生活史的開創(chuàng)性研究, 發(fā)現(xiàn)了腦黏體蟲生活史存在魚和寡毛類(Tubifex tubifex)兩個替換宿主(Alternative host), 放射孢子蟲只是黏體動物在寡毛類宿主體內的一個生活階段。此后, 有關放射孢子蟲的研究日益增多和受到廣泛關注。在系統(tǒng)分類上, Kent等[3]建議將此前的射孢子蟲綱和黏孢子蟲綱合并, 放射孢子蟲綱作為黏孢子蟲綱的同物異名而禁制使用, 但建議保留了原放射孢子蟲綱 17個屬的名稱, 將其看作集合類群(Collective group)用以描述和劃分具有相似形態(tài)特征的放射孢子蟲。在魚類寄生蟲病害方面, 對發(fā)病水體放射孢子蟲的調查和鑒定成為掌握黏孢子蟲病感染、傳播的重要研究內容[4]。目前, 來自匈牙利、美國、日本等國家的學者已開展了大量有關黏孢子蟲病發(fā)生地區(qū)放射孢子蟲區(qū)系調查, 報道了約 200余種類型的放射孢子蟲[4—6], 通過傳統(tǒng)的實驗室感染方法鑒定出40余種魚體寄生黏孢子蟲所對應的寡毛類寄生放射孢子蟲[6]。

黏孢子蟲是我國養(yǎng)殖魚類和野生魚類資源重要的寄生蟲病原, 已報道種類約600余種[7]。其中一些種類對我國魚類養(yǎng)殖造成非常嚴重的危害, 如引起鯉魚腸道巨囊病的吉陶單極蟲(Thelohanellus kitauei), 大量寄生在錦鯉鰓絲引起死亡的野鯉碘泡蟲(Myxobolus koi), 引起草魚腸道糜爛的餅形碘泡蟲(Myxobolus artus), 寄生在鯽魚咽部和肝臟引起大量死亡的洪湖碘泡蟲(Myxobolus honghuensis)和吳李碘泡蟲(Myxobolus wulii)等。然而, 我國黏孢子蟲病的研究大多致力于種類分類、組織病理和流行病學和藥物防治[8—10]。有關黏孢子蟲的感染、傳播、個體發(fā)生、生活史等缺乏詳細的研究, 特別是在黏孢子蟲的放射孢子階段的研究報道屈指可數(shù)。在2000年, 王桂堂和姚衛(wèi)建[11]在國內首次報道了一種三突放射孢子蟲(Triactinomyxon)。此后, 翟艷花等[12,13]分別報道了2種放射孢子蟲(Triactinomyxon和Raabeia); Xi等[14]報道了在池塘黏孢子蟲調查過程中發(fā)現(xiàn)的3種放射孢子蟲(Raabeia, Aurantiactinomyxon和Guyenotia)。

在江蘇地區(qū)黏孢子蟲病高發(fā)池塘放射孢子蟲的區(qū)系調查過程中, 作者發(fā)現(xiàn)了多種放射孢子蟲。本文描述一種Guyenotia 類型放射孢子蟲形態(tài)特征, 并通過 18S rDNA序列克隆和比對發(fā)現(xiàn)該Guyenotia放射孢子蟲可能為一種魚體寄生楚克拉蟲在蘇氏尾鰓蚓寄生發(fā)育階段所對應的放射孢子蟲。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2013年 5月中旬, 在江蘇常州地區(qū)一多年鯽魚養(yǎng)殖塘口, 用采泥器取塘底淤泥, 40目鋼篩篩除淤泥, 收集水蚯蚓。

1.2 實驗方法

水蚯蚓的培養(yǎng) 將收集到的水蚯蚓帶回實驗室, 將水蚯蚓分別轉移到稱量瓶中, 每個稱量瓶(50 mm×30 mm)中3—5條, 并加入約4 mL曝氣自來水, 室溫培養(yǎng)。

水蚯蚓 18S rDNA PCR擴增 實驗所用的提取DNA試劑盒為QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN)。切取水蚯蚓尾部一小段放入滅過菌的1.5 mL的離心管中, 按照說明書的步驟依次進行提取基因組 DNA。水蚯蚓 18S rDNA PCR擴增所用引物為ERIB1 (ACCTGGTTGATCCT GCCAG)和 ERIB10 (CCTCCGCAGGTTCACCTACGG)[15]。PCR反應條件為: 94℃ 預變性5min, 94℃變性30s, 52℃退火30s, 72℃延伸60s, 循環(huán)30次, 最后72℃末端加尾7min。

放射孢子蟲的收集 每天在顯微鏡下觀察水體中是否有水蚯蚓釋放的放射孢子蟲, 一旦檢測到有放射孢子蟲, 將該組水蚯蚓進一步單個培養(yǎng)在稱量瓶中, 以確定釋放放射孢子蟲的蚯蚓個體。在顯微鏡下觀察和記錄,并開始收集有放射孢子蟲的水樣, 直到蚯蚓不再釋放放射孢子蟲為止, 每次收集到的水樣裝入 50 mL的離心管中, 放到–80℃的冰箱中保存起來。

放射孢子蟲形態(tài)特征測量 在光學顯微鏡下觀察該放射孢子蟲的形態(tài), 并用圖森TAC-9.0C顯微攝像進行拍照; 用顯微鏡測微尺對放射孢子蟲進行測量。

放射孢子蟲18S rDNA PCR擴增 將保存在–80℃的樣品取出融化后, 5000 r/min離心10min富集放射孢子蟲?；蚪M提取同樣嚴格按QIAamp DNA Micro Kit 試劑盒說明, 在加 Buffer AL 的時候提前加入 carrier RNA 1 ng。提取的基因組除一部分用于18S rDNA PCR 擴增,其余部分放–20℃冰箱保存。放射孢子蟲18S rDNA采用巢氏PCR 方法擴增。實驗所用外引物為ERIB1和ERIB10;內引物為 Myxosp-F(TTCTGCCCTATCAACTW GTTG)和Myxosp-R(GGTTTCNCDGRGGGMCCAAC)[16]。PCR 反應條件: 第一輪擴增94℃ 預變性5min; 94℃變性30s, 48℃退火45s, 72℃延伸90s, 循環(huán)30次; 72℃末端加尾7min;第二輪擴增 94℃ 預變性 5min; 94℃變性 30s, 52℃退火30s, 72℃延伸60s, 循環(huán)30次; 72℃末端加尾7min。第一輪PCR時, 所加的模板量為10 μL, 第二輪PCR時所加模板量為 3 μL。

PCR 反應液的配制 10×PCR buffer (Mg2+) 5 μL;dNTP Mixture 4 μL; 正向引物(20 μm) 2 μL; 反向引物(20 μm)2 μL; Takara Ex Taq (5 U/μL) 0.5 μL; 補滅菌水至 50 μL。

序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析 PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳回收, 送上海生物工程有限公司測序。獲得的18S rDNA 的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST檢索同源性序列。序列多重比對使用Clustal X軟件[17], 序列間的一致性分析使用MEGA 4.0 軟件[18]。為了分析放射孢子集合類群與黏孢子蟲類群間是否存在對應關系, 通過檢索GenBank中登錄的放射孢子蟲序列, 并Blast比對和下載相似性最高的黏孢子蟲序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析。系統(tǒng)發(fā)育分析在 MEGA4.0[18]軟件中采用最小進化法(Minimum Evolution)、最大似然法(Maximum Likelihood),分支置信度用Bootstrap自展檢驗1000次。

2 結果

2.1 水蚯蚓的鑒定

在調查中采集到的水蚯蚓在蟲體后部具有絲狀的鰓。這一形態(tài)特征是環(huán)節(jié)動物寡毛類尾鰓蚓典型特征。PCR擴增獲得水蚯蚓18S rDNA 序列片段長度為1803 bp。序列比對分析表明該水蚯蚓與 GenBank 中的蘇氏尾鰓蚓(Branchiura sowerbyi)(DQ459985)的序列一致性最高(99.8%)。因此可以鑒定該水蚯蚓為蘇氏尾鰓蚓。

2.2 放射孢子蟲鑒定

放射孢子蟲的檢測 通過連續(xù) 2周的顯微鏡檢查, 在采集到的400條水蚯蚓中僅檢查到1條釋放出本文報道的放射孢子蟲, 感染率為0.25%。蘇氏尾鰓蚓每天釋放放射孢子蟲的高峰出現(xiàn)在下午。

放射孢子蟲的形態(tài)特征 檢查到的放射孢子蟲呈Guyenotia集合類群的典型特征。孢體呈球形, 無孢柄, 極囊呈三個點狀緊簇的位于胞體頂部, 三個尾柄呈指狀且末端較鈍, 尾柄核近尾柄末端。孢體長 10.7 μm (10.0—12.1); 極囊 1.8 μm (1.7—2.0); 尾柄長 20.5 μm (17.4—23.8), 寬5.8 μm (4.8—6.3)。為了便于區(qū)別該類群其他放射孢子蟲, 作者根據(jù)目前慣例將其命名為 Guyenotia type CZ (圖 1、圖 2)。

表1 本文描述放射孢子蟲與文獻報道中相似放射孢子蟲的形態(tài)學比較Tab. 1 Comparison of measurements of the newly identified and the known Guyenotia types reported in scientific literatures

圖1 Guyenotia type CZ放射孢子蟲的整體形態(tài)(標尺=10 μm)Fig. 1 Morphology of the Guyenotia type (Scale bar = 10 μm)

圖2 Guyenotia type CZ放射孢子蟲的側面觀(標尺=10 μm)Fig. 2 Lateral view of the Guyenotia type (Scale bar = 10 μm)

18S rDNA 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析 PCR擴增獲得的放射孢子蟲18S rDNA 序列為935 bp(GenBank 登錄號為 KF912153)。NCBI中 BLAST比對分析顯示本報道的 Guyenotia放射孢子蟲 18S rDNA 序列與兩極科(Myxidiidae)的楚克拉屬(Zschokkella)和兩極蟲屬(Myxidium)的孢子蟲, 以及球孢科(Sphaerosporidae)的Sphaerospora sp.(AY735411)具有較高遺傳相似性。其中,Guyenotia type CZ2013與GenBank中的Zschokkella sp.(DQ118776)、Sphaerospora sp. (Eszterbauer, et al.[22]AY735411)和放射孢子蟲 Guyenotia (Eszterbauer, et al.[21]AY779063)的序列一致性最高, 分別為 98.2%、98.1%、97.7%。在構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中(圖 3), 本文報道的 Guyenotia type CZ 與 Zschokkella sp. (DQ118776)、Guyenotia (AY779063)穩(wěn)定的聚為一個分支。

3 討論

自 Wolf 和 Markiw[2]首次證實放射孢子蟲是黏孢子蟲一個早期形態(tài)階段后, 這個發(fā)現(xiàn)已經(jīng)被大家所認可,并陸續(xù)被研究者報道; 到目前為止報道的放射孢子蟲有200多種(17個組合群)。在放射孢子蟲類群的鑒定中, 孢體的形狀、孢柄的有無、尾柄在胞體后發(fā)生位置和尾柄形狀都是非常重要的鑒定特征。本文描述的放射孢子蟲(圖1、圖 2)孢子體呈球形, 極囊呈三個點狀緊簇的位于胞體頂部, 尾柄呈三個指狀且末端較鈍, 尾柄核近尾柄末端,這些形態(tài)特征為Guyenotia類群的典型特征, 因此將該放射孢子蟲劃歸為該集合類群。通過形態(tài)特征比較, 本文報道的放射孢子蟲與文獻中已報道Guyenotia類群的放射孢子蟲同時存在以下形態(tài)差異: (1)寄生宿主不同, 表1中所報道的放射孢子蟲的宿主多為正顫蚓、夾雜帶絲蚓這 2種寡毛類動物, 而本文報道的放射孢子蟲的宿主為蘇氏尾鰓蚓。(2)形態(tài)大小有差異, 如表1中 Eszterbauer等[20]所報道的 Guyenotia 類型放射孢子蟲的尾突長度為15—21 μm, 寬度為 3.5—5.5 μm, 孢子體長度為 9.5—12 μm,極囊為1.3—2 μm; Xiao等[19]所報道的Guyenotia 類型放射孢子蟲的尾突長度為21 μm寬度為4.5—6.4 μm, 孢子體長度為9.5 μm, 極囊為3 μm。從這些數(shù)據(jù)上可以看出與本文所描述的放射孢子蟲有差別。(3)本文報道的放射孢子蟲的極囊占孢子體的比例與 Eszterbauer等[21]報道的Guyenotia類型的放射孢子蟲的差異明顯, 后者的極囊/孢子體要小于本文報道的, 雖然整體形狀都歸為同一類群,但是極囊占孢子體的位置也有很大的區(qū)別, 比如后者極囊排列緊密。本文報道的放射孢子蟲與 Xi等[14]報道的Guyenotia放射孢子蟲在形態(tài)、個體大小和宿主非常相似,可能為同一種放射孢子蟲。然而, 由于放射孢子蟲的形態(tài)特征非常簡單, 僅僅依據(jù)形態(tài)很難做出準確的鑒定[20]。此外, Xi等[14]報道的 Guyenotia放射孢子蟲由于沒有提供DNA序列, 本文也無法通過分子序列對其進行比較分析。

作者在比較GenBank中Sphaerospora sp. (AY735411)(采集自鯽魚腎小管), 和 Zschokkela sp. (DQ118776)(采集自鯽魚膽管)的序列時發(fā)現(xiàn)這2個來自不同黏孢蟲科的孢子蟲18S rDNA序列完全一致。在Fiala[23]構建的黏孢子蟲 18S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹中(見文章中 Fig. 5),Sphaerospora sp. (AY735411)單個聚類在整個兩極科大分支中。因此, 作者傾向于認為 Eszterbauer 和 Szekely[22]在GenBank中登錄的Sphaerospora sp. 序列(AY735411)可能由于采樣過程樣品污染, 或組織同時感染有 2種黏孢子蟲導致出現(xiàn)的錯誤; Zschokkella sp. (DQ118776)的鑒定和DNA測序結果應該是正確的。Eszterbauer等[21]在運用18S rDNA 序列鑒定放射孢子蟲Guyenotia (AY779063)時也注意到該放射孢子蟲與Sphaerospora sp. (AY735411)和Zschokkella sp. (DQ118776)的序列一致性分別為100%和99.9%。

在黏孢子蟲種類鑒定中, 不同種的種內18S rDNA序列差異沒有統(tǒng)一界限, 種內差異通常在1%—3%[24—26]。本文報道的Guyenotia type CZ 與楚克拉(Zschokkella sp.DQ118776)的序列一致性為98.2%, 系統(tǒng)發(fā)育分析中其與兩極科楚克拉屬聚為一支, 因此, 作者認為Guyenotia type CZ應屬于楚克拉屬(Zschokkella )的黏孢子蟲在蘇氏尾鰓蚓寄生階段所對應的放射孢子蟲。

自 Kent等[3]廢止射孢子蟲綱類群有效后, 放射孢子蟲綱下原有的屬名被以集合類群(Collective group)形式保留, 用于描述和劃分具有相似形態(tài)特征的放射孢子蟲。目前, 發(fā)現(xiàn)不同水體中的放射孢子和鑒定其所對應的魚體寄生黏孢子蟲種類引起寄生蟲學和魚病學研究人員廣泛關注。然而, 根據(jù)本文構建的放射孢子蟲和黏孢子蟲系統(tǒng)發(fā)育樹, 放射孢子蟲的集合類群和黏孢子蟲各屬間沒有呈現(xiàn)清晰的對應關系。如與碘泡屬(Myxobolus)的黏孢子蟲存在對應關系的放射孢子蟲類群有 Triactinomyxon、Aurantiactinomyxon、Raabeia、Hexactinomyxon等。因此,從放射孢子蟲形態(tài)特征去推斷其歸屬于某個黏孢子蟲屬種類沒有規(guī)律可循。放射孢子蟲的鑒定需要通過傳統(tǒng)的實驗室感染或DNA分子序列分析。實驗室感染通常耗時較長, 而分子鑒定較為快速、便捷和準確。