孫 雯，潘秀珍

基于豬鏈球菌2型烯醇化酶建立的篩查并監(jiān)控細(xì)菌侵襲性感染的ELISA方法

*孫 雯1，潘秀珍2

（1.揚(yáng)州職業(yè)大學(xué)，江蘇，揚(yáng)州 225000; 2.南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所，江蘇，南京 210002)

探索豬鏈球菌2型（2）重組烯醇化酶（Enolase）蛋白的免疫學(xué)特性，建立調(diào)查2 侵襲性感染的標(biāo)記和方法，并用于人群及豬群中2 感染的監(jiān)控和篩選有效的疫苗抗原。PCR 法檢測(cè)在各血清型菌株中的分布情況，免疫印記檢測(cè) Enolase 的免疫反應(yīng)性，建立篩查2 感染的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法。PCR 檢測(cè)顯示在多種血清型中廣泛存在，Western-blot 表明重組Enolase 蛋白具有較好的免疫反應(yīng)性?；?Enolase 建立的 ELISA 結(jié)果顯示，感染2 的豬血清中Enolase 抗體效價(jià)較高?；贓nolase 建立的ELISA 方法能有效地用于2 感染的篩查和監(jiān)控。

豬鏈球菌2型（2）；烯醇化酶Enolase；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；ELISA

豬鏈球菌2型(2）是重要的人畜共患病原菌。迄今為止，2 已在20多個(gè)國(guó)家和地區(qū)導(dǎo)致了200多起人群的惡性感染事件，造成的臨床疾病包括腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎等[1]。尤為值得關(guān)注的是，江蘇（1998年）、四川（2005年）兩省暴發(fā)了2 大規(guī)模流行感染豬和人的疫情，病人臨床表現(xiàn)為國(guó)內(nèi)外罕見(jiàn)的中毒性休克綜合征（STSS）[1-2]。2 致病機(jī)理復(fù)雜，雖有諸多研究，但尚未明確。目前，也缺乏有效的疫苗及方法預(yù)防并檢測(cè)豬鏈球菌病。細(xì)菌的表面成分不僅涉及細(xì)菌的防御機(jī)制，同時(shí)也與細(xì)菌的毒力有密切關(guān)系，例如黏附、定植、侵襲、組織中的穿梭等[3-4]。近來(lái)發(fā)現(xiàn)烯醇化酶（Enolase，ENO）不僅在細(xì)菌體內(nèi)參與基礎(chǔ)代謝，也能出現(xiàn)在多種病原菌胞外參與感染過(guò)程[5-6]。

抗體水平的免疫監(jiān)控是疾病預(yù)防控制的一項(xiàng)重要措施，但目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有研制出快速、可靠、穩(wěn)定的檢測(cè)2 特異性抗體的免疫學(xué)方法。有關(guān)課題組前期已成功表達(dá)出2 中國(guó)強(qiáng)毒株 05ZYH33 的融合蛋白His-ENO[7-8]，本研究將進(jìn)一步探索 Enolase 蛋白免疫學(xué)特性，旨在基于 Enolase 建立臨床調(diào)查2 侵襲性感染的酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)方法用于人群及豬群中2 感染的監(jiān)控，為后續(xù)2 以及2 以外多個(gè)血清型致病機(jī)理的研究和相關(guān)預(yù)防監(jiān)測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

2（98T003、98012、HAbb、ZY05、HA68、261、266來(lái)自中國(guó)，S735來(lái)自加拿大，SS2-N 來(lái)自德國(guó)，T15來(lái)自荷蘭）10株；血清型標(biāo)準(zhǔn)參考株31株（加拿大Marecelo Gottschalk教授惠贈(zèng)）；2 05ZYH33 重組Enolase蛋白、兔抗 05ZYH33 抗血清為本實(shí)驗(yàn)室制備；恢復(fù)期SPF豬血清（陽(yáng)性對(duì)照），未感染的SPF豬血清（陰性對(duì)照）為本實(shí)驗(yàn)室保存；86份豬血清采集于江蘇的農(nóng)場(chǎng)和屠宰場(chǎng)；硝酸纖維素膜為Amersham Pharmacia Biotech產(chǎn)品；酶結(jié)合物HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、酶結(jié)合物HRP標(biāo)記羊抗豬IgG（Sigma）；OPD（O-phenylenediamine）（Amresco）；96孔ELISA板（Greiner bio-one Germany）。

1.2 方法

1.2.1基因在各血清型和非菌株中的分布

以多種國(guó)際血清型、國(guó)內(nèi)外2 的基因組為模板，PCR擴(kuò)增目的基因，1%瓊脂糖凝膠電泳分析。引物由上?；瞪镉邢薰竞铣?，上游引物為：

5-GCGGATCCATGTCAATTATTACTG-3；下游引物為：5-GCCTCGAGTTATTTT TTCAAGTTGTAG-3。

1.2.2 Enolase 蛋白的 Westernblot 分析

采用電轉(zhuǎn)印法。將 12% SDS-PAGE 電泳后膠上的重組蛋白 Enolase轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)印緩沖液: 39 mmol/L甘氨酸，48 mmol/L Tris Cl，0.037% SDS，20% 甲醇）至硝酸纖維素膜上，5% 脫脂奶封閉1 h。TBST（10 mmol/L Tris Cl，0.9% NaCl，0.5% Tween20，pH 7.5）洗三次，加兔抗 05ZYH33 抗血清（1: 100）37 ℃孵育 1 h。TBST 洗三次，再加 HRP 標(biāo)記的羊抗兔 IgG（1: 1000）37 ℃孵育 1 h。TBST 洗三次，DAB 顯色（鄰苯二胺 DAB 6 mg，0.3% CoCl21 mL，30% H2O210 μL），待有條帶出現(xiàn)，立即用蒸餾水清洗以終止反應(yīng)。

1.2.3 Enolase 抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)方法的建立

1.2.3.1 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定

Enolase蛋白和2 全菌超聲波破碎后作為抗原分別按10、5、1、0.5、0.1 μg/mL的濃度，置4℃包被過(guò)夜。SPF 豬陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清按1: 100倍比稀釋至1: 800，分別加到不同濃度包被的孔里，37°C孵育1 h。加入HRP 標(biāo)記羊抗豬IgG（1: 1000），37 °C孵育1 h。底物顯色，酶標(biāo)儀讀取490 nm波長(zhǎng)下OD值。P為陽(yáng)性血清OD值，N為陰性血清OD值，以P值接近1、P/N值最大時(shí)抗原的稀釋倍數(shù)為抗原最佳工作濃度，此時(shí)對(duì)應(yīng)的血清稀釋度為最佳血清稀釋度。

1.2.3.2 二抗最佳稀釋濃度和作用時(shí)間的確定

將抗原按最佳工作濃度包被酶標(biāo)板，洗滌后加最佳稀釋度的SPF豬陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清，37℃作用1 h。酶標(biāo)記的羊抗豬 IgG 按1: 1000倍比稀釋至1: 4000，每個(gè)稀釋度做3個(gè)復(fù)孔。37 ℃分別作用45、60、90 min，顯色后490 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。以陽(yáng)性血清 OD 值接近1、P/N 值最大時(shí)酶結(jié)合物的稀釋濃度為二抗最佳工作濃度和最佳作用時(shí)間。

1.2.3.3 最佳包被液、封閉液的確定

分別用0.01 M PBS（pH7.4），1M Tris-Cl（pH=8.0）和0.05 M碳酸鈉和碳酸氫鈉緩沖液（pH=9.6）稀釋抗原至最佳工作濃度進(jìn)行包被，加最佳稀釋度的陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清、最佳工作濃度羊抗豬IgG，以O(shè)D值接近1、P/N 值為最大為最佳包被液。未包被抗原的酶標(biāo)孔分別加入 PBST 稀釋的5 % 脫脂奶粉、1 % BSA、2 % 明膠（復(fù)孔），37℃作用2 h，加最佳稀釋濃度豬陽(yáng)性對(duì)照血清、最佳稀釋濃度羊抗豬IgG，以O(shè)D值最低為最佳封閉液。

1.2.3.4 Enolase 抗體的 ELISA 檢測(cè)及結(jié)果的判讀

將重組Enolase蛋白和2全菌超聲裂解蛋白按各自最佳工作濃度包被96孔酶標(biāo)板。分別加入最適封閉液、最佳稀釋度的SPF豬陽(yáng)性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清（各10份）、最佳濃度的羊抗豬IgG，酶標(biāo)儀讀取490 nm波長(zhǎng)的OD值。P 為10份陽(yáng)性血清孔的 OD 平均值，N 為10份陰性血清孔的OD平均值，計(jì)算/值。用上述方法檢測(cè)86份采集于江蘇農(nóng)場(chǎng)和屠宰場(chǎng)的待測(cè)豬血清，P’值為待檢血清孔的OD值，將P’/ N值大于P / N值的樣本判定為感染陽(yáng)性樣本。

2 結(jié)果

2.1 PCR分析 enolase 基因在 S. suis 血清型中的存在情況

PCR法分別對(duì)多個(gè)血清型的標(biāo)準(zhǔn)參考株和國(guó)外的2 型3株（S735、SS2-N 和 T15）、國(guó)內(nèi)分離的2 型61株進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果除了7、29、31和32型以外，其余包括1、2、1/2和9型在內(nèi)的27個(gè)血清型都擴(kuò)增出目的條帶；2株國(guó)外2 型分離株和58株國(guó)內(nèi)2 型分離株全部擴(kuò)增出目的條帶，而無(wú)毒株2 T15 中沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶（結(jié)果如表1）。

表1 PCR 檢測(cè)eno 基因在各菌株中的分布

+: positive; --: negative;溶血素基因莢膜多糖基因溶菌酶釋放蛋白基因；胞外蛋白因子基因

2.2 Enolase 蛋白的 Western blot 分析

Western blot 結(jié)果顯示，重組 Enolase 蛋白可以與全菌兔抗 05ZYH33 抗血清反應(yīng)，在特定位置處有明顯的條帶（圖1），表明重組 Enolase 蛋白具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性。

1:蛋白標(biāo)記物，2:重組Enolase與全菌兔抗 05ZYH33 抗血清結(jié)合條帶

2.3 基于S. suis 2 Enolase蛋白的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用

2.3.1 E LISA 檢測(cè)最佳條件的確定

經(jīng)方陣結(jié)果篩選顯示，Enolase最佳包被濃度為0.5 μg/mL，豬血清最佳稀釋度為1: 200；全菌超聲波抗原最佳包被濃度為5 μg/mL，豬血清最佳稀釋度為 1: 100。HRP 羊抗豬 IgG 最佳稀釋度為1: 1000，作用時(shí)間為1 h。不同的包被液包被抗原，P/N 值相差不多，但碳酸鹽緩沖液包被時(shí)陰性值最小，故選擇 0.05 M 碳酸鈉和碳酸鹽緩沖液（pH=9.6）為最佳包被液。封閉液為5%脫脂奶粉時(shí)陰性值最低，P/N值最大。

2.3.2 豬血清 ELISA 檢測(cè)結(jié)果

以重組Enolase 為包被抗原，已知10份陽(yáng)性豬血清和10份陰性豬血清的OD490平均值(和)分別為0.578和0.275，二者的比值為2.1。ELISA檢測(cè)86份豬血清樣品，將待測(cè)樣本值P’與的比值≧2.1的樣本判定為陽(yáng)性感染樣本(圖2)，結(jié)果顯示該方法可以清楚地分辨陽(yáng)性、可疑的和陰性樣本。

——陽(yáng)性基準(zhǔn)線 ------陰性基準(zhǔn)線

（基于ENO建立的對(duì)于豬血清樣本的ELISA檢測(cè).86份豬血清采集于江蘇的農(nóng)場(chǎng)和屠宰場(chǎng)）

3 討論

35 種血清型中，1、2、1/2、9型是主要致病血清型，尤其是2型流行最廣、致病性最強(qiáng)。本研究中，通過(guò) PCR 分析基因在不同血清型中的存在情況，結(jié)果顯示基因在包括1、2、1/2和9型在內(nèi)的27個(gè)血清型，以及來(lái)自不同地理區(qū)域的多株2分離株中普遍存在，表明有可能作為感染2 及其他致病型的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)的檢測(cè)指標(biāo)。免疫印記顯示 Enolase 可以與全菌兔抗 05ZYH33 抗血清反應(yīng)，說(shuō)明Enolase 具有很好的免疫反應(yīng)性[5]。由于基因存在于大部分血清型中，表明重組 Enolase 在建立感染的血清學(xué)診斷方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

抗體水平的免疫監(jiān)控是疾病預(yù)防控制中的一項(xiàng)常用重要措施，基于莢膜多糖的間接ELISA（CPS-ELISA）曾用于2感染仔豬的血清中抗CPS抗體的檢測(cè)，但發(fā)病豬和非發(fā)病豬間的抗體滴度無(wú)明顯差異。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)檢測(cè)體系的最適條件進(jìn)行優(yōu)化，基于Enolase建立了一個(gè)有效篩查2感染的ELISA方法，將能夠很好地應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室、臨床及野外對(duì)2感染的監(jiān)測(cè)。

本研究結(jié)果表明Enolase在建立2感染的血清學(xué)診斷方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值，基于Enolase建立的篩查2感染的ELISA方法，將能很好地應(yīng)用于人群及豬群中2 感染的監(jiān)控。此外，該研究為深入探索2及2 以外多個(gè)血清型的致病機(jī)理、建立快速可靠的免疫學(xué)檢測(cè)方法提供了思路。

[1] Arends J P, Zanen H C. Meningitis caused byin humans[J]. Review of Infectious Diseases, 1988, 10(1): 131-137.

[2] Yu H, Jing H, Chen Z, et al. Humanoutbreak, Sichuan, China[J]. Emerging infectious diseases, 2006, 12(6):27-29.

[3] Reed G H, Poyner R R, Larsen T M, et al. Structural and mechanistic studies of enolase[J]. Current opinion in structural biology, 1996, 6(6): 736-743.

[4] Bergmann S, Rohde M, Chhatwal G S, et al. α‐Enolase ofis a plasmin (ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface[J]. Molecular microbiology,2001,40(6): 1273-1287.

[5] Fontán P A, Pancholi V, Nociari M M, et al. Antibodies to streptococcal surface enolase react with human α-enolase: implications in poststreptococcal sequelae[J]. Journal of Infectious Diseases, 2000, 182(6): 1712-1721.

[6] Veiga‐Malta I, Duarte M, Dinis M, et al. Enolase fromis an immunosuppressive protein [J]. Cellular microbiology, 2004, 6(1): 79-88.

[7] 孫雯,潘秀珍,王長(zhǎng)軍,等. 豬鏈球菌2型烯醇化酶的分子克隆與免疫學(xué)特性：暗示了其在該病原菌急性感染過(guò)程的角色[J].Microbiology,2008,35(1):15-19.

[8] 孫雯,潘秀珍.表面蛋白烯醇化酶Enolase在2感染中的角色[J].井岡山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2010,31(3): 43-45.

AN ELISA METHOD BASED ON RECOMBINANT ENOLASE SCREENING AND INVASIVE INFECTION MONITORING OF2

*SUN Wen1, PAN Xiu-zhen2

（1.Yangzhou Vocational College, Yangzhou, Jiangsu 225000, China; 2. Institute of Military Medical Sciences, Nanjing Command, Nanjing, Jiangsu 210002, China)

：To study the immunological characters of recombinant Enolase from2, establish a mark and a method for investigating its invasive infection and apply them in monitoring its infection and screening valid vaccine antigen among crowd and swinery.：PCR was adopted to analyze the distribution ofgene in all kinds ofserotype, western-blot experiment was used to detect the immunoreactivity of Enolase, and eno-based ELISA method was established for screening2 infection.：PCR results showed thatgene widely existed in many serotypes of, western-blot experiment demonstrated recombinant Enolase had stronger immunoreactivity. Evaluation of Eno-based ELISA indicated that serum samples from pigs with2 infection have higher levels of antibody titers.: ELISA provided an efficient Eno-based method for screening and monitoring the infection of2.

serotype 2 (2); enolase; ELISA

S855.99

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2014.04.017

1674-8085(2014)04-0080-04

2014-03-17；

2014-05-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30670105、30600533)；國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA0Z455)；江蘇省科技計(jì)劃項(xiàng)目（自然科學(xué)基金項(xiàng)目）(BK2007013)

*孫 雯(1983-)，女，江蘇揚(yáng)州人，講師，碩士生，主要從事基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的教學(xué)與科研工作(E-mail：wen-sun@163.com);

潘秀珍(1962-)，女，江蘇南京人，研究員，博士，主要從事流行病學(xué)的科研工作(E-mail：panxiuzhen-2004@163.com).