冀全博，徐小潔，張強(qiáng)，康磊，李玲，黃蓉，周麗英 ，王榮福，王巖，葉棋濃

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；2.解放軍總醫(yī)院 骨科，北京 100853；3.北京大學(xué) 第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，北京 100034

1型酪蛋白激酶（casein kinase 1，CK1）是一類具有獨(dú)特理化特性的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其家族序列高度保守[1]，并廣泛存在于哺乳動物、酵母等真核生物的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜及細(xì)胞骨架等部位[2]，參與調(diào)節(jié)包括基因表達(dá)、囊泡運(yùn)輸、生物節(jié)律、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控等多種過程[3]。

q CK1表達(dá)水平及活性的變化能促進(jìn)腫瘤發(fā)生，并通過一系列細(xì)胞內(nèi)信號通路調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展[4]。為此，我們構(gòu)建了帶有FLAG標(biāo)簽的CK1的真核表達(dá)載體，并研究該激酶在骨肉瘤U2OS細(xì)胞、乳腺癌ZR-75-1細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞中的表達(dá)及定位情況，為進(jìn)一步深入探討腫瘤發(fā)生的潛在分子標(biāo)記物和藥物治療靶點(diǎn)的深層次研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

骨肉瘤U2OS細(xì)胞、乳腺癌ZR-75-1細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞由本室傳代培養(yǎng)；大腸桿菌DH5α、人乳腺文庫、pCMV-Tag2B載體為本室保存；XhoⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶、高保真primerSTAR DNA聚合酶、T4DNA連接酶、Taq酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；PCR回收試劑盒、膠回收、質(zhì)粒提取試劑均來自Pro?mega公司；轉(zhuǎn)染試劑Vigofect為威格拉斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；小鼠源抗FLAG標(biāo)簽單抗（mAb）αm-FLAG和HRP標(biāo)記的抗FLAG標(biāo)簽小鼠源mAb購自Sigma公司；FTTC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購自San?ta Cruz公司；引物由北京賽百盛生物技術(shù)公司合成；測序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 人CK1全長編碼區(qū)序列的擴(kuò)增

以人乳腺文庫為模板，根據(jù)文獻(xiàn)報道的人CK1 CDS序列合成上游引物（5'-CGGGATCCATGTCGG GACCCGTGCCAAGCAG-3'）和下游引物（5'-CGGA ATTCTTACTGCTGAGCGCCAGCGGCAGC-3'），PCR擴(kuò)增CK1編碼區(qū)全長（95℃ 5 min，以95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min進(jìn)行32個循環(huán)，72℃延長7 min；使用高保真primerSTAR DNA聚合酶）。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定

用XhoⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶雙酶切pCMVTag2B載體（37℃，4 h），經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR產(chǎn)物膠回收后用XhoⅠ和HindⅢ雙酶切，形成帶有黏性末端的雙鏈，用T4DNA連接酶連接到pCMV-Tag2B載體中，得到重組質(zhì)粒pCMV-Tag2B-CK1，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，培養(yǎng)后菌液PCR鑒定陽性的提取質(zhì)粒，用XhoⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送北京奧科生物公司測序。

1.4 哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將骨肉瘤U2OS細(xì)胞、乳腺癌ZR-75-1細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞接種于6孔板中含10%胎牛血清的雙抗DMEM培養(yǎng)基中，接種細(xì)胞密度以80%為宜，培養(yǎng)12 h后按常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 h換液。將2 μL Vigofect與100 μL NaCl混合，取5 μg重組質(zhì)粒與100 μL NaCl混合，再將上述2種溶液混合，室溫放置15 min，加入6孔板中，并以同樣的方法轉(zhuǎn)染空pCMV-Tag2B作為對照，37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后4～6 h換液。

1.5 SDS-PAGE和Western印跡檢測FLAG-CK1的表達(dá)

將pCMV-Tag2B-CK1重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入骨肉瘤U2OS細(xì)胞、乳腺癌ZR-75-1細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞，提取蛋白，加入2×SDS上樣緩沖液，100℃水浴15 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用50 g/L脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，加入用50 g/L脫脂奶粉以1∶3000稀釋的HRP標(biāo)記的抗FLAG標(biāo)簽的小鼠mAb，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

1.6 細(xì)胞免疫熒光檢測FLAG-CK1的細(xì)胞定位

將骨肉瘤U2OS細(xì)胞、乳腺癌ZR-75-1細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞分別接種于6孔板，用pCMV-Tag2BCK1重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，用PBS洗3次，胰酶消化2 min；分別將3種消化后的細(xì)胞接種至12孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，接種密度以5%為宜，12孔板各孔中預(yù)先分別置入3個1 cm圓形蓋玻片，待細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)基，加入預(yù)先配制的40 g/L的多聚甲醛室溫固定30 min；用含10%山羊血清的PBS封閉30 min，加入1∶200稀釋的小鼠源抗FLAG標(biāo)簽的mAb（αm-FLAG），37℃孵育1.5 h；用含10%山羊血清的PBS洗3次，每次10 min；用1∶200稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（αm-FITC）37℃孵育1 h，用1×PBS漂洗3次，每次10 min；用終濃度為1 μg/mL的DAPI染細(xì)胞核10 min，用1×PBS漂洗3次，每次5 min；在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)融合蛋白2B-FLAG-CK1的表達(dá)及定位。

2 結(jié)果

2.1 人CK1基因編碼區(qū)的擴(kuò)增

以人乳腺文庫作為模板，PCR擴(kuò)增獲得約1170 bp的產(chǎn)物，與預(yù)期片段大小一致（圖1）。

2.2 pCMV-Tag2B-CK1重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

圖1 PCR擴(kuò)增目的基因

用XhoⅠ和HindⅢ雙酶切PCR產(chǎn)物后與經(jīng)同樣雙酶切的pCMV-Tag2B載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，培養(yǎng)后菌液PCR鑒定，篩選目的條帶大小接近1170 bp的陽性克?。▓D2），提取質(zhì)粒后酶切鑒定，可切出2條長度分別約為5000和1170 bp的條帶（圖3），表明CK1基因的CDS序列已插入pCMVTag2B上游的多克隆位點(diǎn)中。測序結(jié)果顯示，與已知人CK1基因的編碼序列完全一致（序列略）。

2.3 SDS-PAGE和Western印跡檢測CK1融合蛋白的表達(dá)

將構(gòu)建的pCMV-Tag2B-CK1重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染骨肉瘤U2OS細(xì)胞、乳腺癌ZR-75-1細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞，24 h后提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，Western印跡檢測2B-FLAG-CK1蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，在相對分子質(zhì)量約40 000處能夠檢測到明顯的特異性條帶，說明2B-FLAG-CK1融合蛋白在上述3種細(xì)胞中獲得正確表達(dá)，而空載體則無蛋白表達(dá)（圖4）。

2.4 細(xì)胞免疫熒光檢測2B-FLAG-CK1在骨肉瘤U2OS細(xì)胞、乳腺癌ZR-75-1細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞中的定位

圖2 菌液PCR鑒定

圖3 表達(dá)載體的雙酶切鑒定

圖4 重組蛋白表達(dá)的Western印跡

將pCMV-Tag2B-CK1重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染骨肉瘤U2OS細(xì)胞、ZR-75-1細(xì)胞、HepG2細(xì)胞，24 h常規(guī)培養(yǎng)并處理后，于熒光顯微鏡下觀察CK1融合蛋白在細(xì)胞中的定位（圖5），發(fā)現(xiàn)2B-FLAG-CK1蛋白在3中細(xì)胞的胞核和胞質(zhì)中均有分布，在U2OS、HepG2細(xì)胞胞質(zhì)中的信號強(qiáng)于胞核中，而在ZR-75-1細(xì)胞胞核中的信號強(qiáng)于胞質(zhì)中。

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與蛋白質(zhì)磷酸化水平的異常調(diào)節(jié)密切相關(guān)，而蛋白質(zhì)磷酸化作為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾（磷酸化、甲基化、乙?；⑻腔龋┲械闹匾愋椭?，參與調(diào)控代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分裂等不同過程[5]。CK1作為鈣黏著蛋白功能的重要調(diào)控因子，可通過與細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架、某些細(xì)胞表面受體及細(xì)胞核因子的穩(wěn)定結(jié)合，參與蛋白質(zhì)的級聯(lián)磷酸化過程[6]，從而調(diào)節(jié)生理功能[7]。

CK1還參與調(diào)節(jié)Wnt、Hedgehog信號通路及細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡，通過磷酸化作用直接或間接參與Dv1-1、APC、Axin和β-catenin的磷酸化反應(yīng)[8]，并能夠 與 MDM2（mutine double minute chromosome 2）共同調(diào)節(jié)p53蛋白的磷酸化[9-10]及缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1的調(diào)控[11]，還能負(fù)向調(diào)控E鈣粘連蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞黏附[12]。CK1調(diào)節(jié)功能的紊亂，可影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。鑒于此，我們設(shè)計(jì)并完成了CK1真核表達(dá)載體的構(gòu)建，并確定了其在不同腫瘤細(xì)胞中的定位。

圖5 細(xì)胞免疫熒光檢測2B-FLAG-CK1在腫瘤細(xì)胞中的定位

另已發(fā)現(xiàn)，CK1δ/ε在結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌中可通過抑制凋亡或激活β-catenin信號通路影響腫瘤進(jìn)展[10]。CK1γ2可磷酸化轉(zhuǎn)移性腫瘤抗原1（me?tastastic tumor antigen 1，MTA1），并調(diào)節(jié)其功能[13]，而最近對MTA1轉(zhuǎn)基因小鼠的研究，證明CK1在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中也有重要作用[14]。研究還表明，CK1可作為惡性黑色素瘤的診斷分子標(biāo)記物，對腫瘤的侵襲和代謝產(chǎn)生影響[15]。

因此，CK1的真核表達(dá)及其在不同腫瘤細(xì)胞系中的定位研究，對闡明CK1調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)程的作用，更好地研制抗腫瘤藥物、制定腫瘤治療新策略具有重要意義。

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