張博，康懷興，米志強(qiáng),安小平,張飛雄，童貽剛

1.首都師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071

炭疽是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的烈性傳染病，其病原體為炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）。由于其高毒性，炭疽桿菌是一種潛在的生物武器，曾被作為致死戰(zhàn)劑之一。目前，皮膚炭疽在我國(guó)各地還有散在發(fā)生，不應(yīng)放松警惕。因此，發(fā)展快速、靈敏的炭疽桿菌檢測(cè)方法具有重要意義[1-3]。

噬菌體裂解酶是噬菌體在感染宿主菌末期表達(dá)的蛋白質(zhì)，它通過(guò)水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖使子代噬菌體釋放[4-5]。γ噬菌體裂解酶（γ phage lysin，PlyG）能夠特異性地殺死炭疽桿菌，同時(shí)也能裂解蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）RSVF1（ATCC 4342）菌株，且RSVF1是惟一對(duì)PlyG敏感的蠟樣芽孢桿菌菌株[6]。Yemini等就曾以蠟樣芽孢桿菌為模型，研究了基于噬菌體的炭疽桿菌檢測(cè)方法[7]；李曼等也以蠟樣桿菌RSVF1芽孢為模型，進(jìn)行了殺滅試驗(yàn)的相關(guān)研究[8]。

ATP普遍存在于所有活的生物體中，當(dāng)生物體死亡后，在細(xì)胞內(nèi)酶的作用下，ATP很快被分解掉。所以通過(guò)測(cè)定樣品中的ATP濃度，即可推算出活菌數(shù)[9]。在Mg2+存在下，螢火蟲(chóng)螢光素酶（luciferase，Luc）以D-螢光素、ATP、O2為底物，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，發(fā)出熒光。據(jù)此，可對(duì)微生物細(xì)胞內(nèi)的ATP進(jìn)行測(cè)定，從而定量檢測(cè)細(xì)菌數(shù)[10-11]。

國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究都曾以蠟樣芽孢桿菌RSVF1為對(duì)象來(lái)替代炭疽桿菌，并且Schuch等[6]的研究也充分證明PlyG對(duì)于RSVF1和炭疽桿菌具有明顯的裂解酶活性，而不能裂解其他菌株。本研究以此為基礎(chǔ)，以蠟樣芽孢桿菌RSVF1為指示菌，通過(guò)結(jié)合裂解酶與ATP生物發(fā)光法，進(jìn)行了對(duì)炭疽桿菌定性定量檢測(cè)的模擬實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

蠟樣芽孢桿菌RSVF1購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC），其他菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆菌株大腸桿菌Trans1-T1、表達(dá)菌株大腸桿菌BL21（DE3）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司；質(zhì)粒pUC19-plyG、pLenti-luc為本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性?xún)?nèi)切酶NdeⅠ、EcoRⅠ-HF和T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成；2×TransTaq HiFi PCR SuperMixⅡ購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；DNA marker、蛋白質(zhì)marker和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自北京博邁德生物技術(shù)有限公司；鎳柱預(yù)裝柱購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；螢光素酶檢測(cè)試劑盒、D-螢光素（甲蟲(chóng)螢光素，鉀鹽）購(gòu)自Promega公司；Profile-1 3560（10X）ATP微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自北京浩正智信科技有限公司；其它常規(guī)試劑由本實(shí)驗(yàn)室自備；BHI（brain heart infusion）培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD醫(yī)療器械有限公司，LB培養(yǎng)基為自配。

1.2 plyG和luc基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)已知的質(zhì)粒pUC19-plyG和pLenti-luc的序列設(shè)計(jì)引物[12-13]，在2組引物的上游均加入His標(biāo)簽（斜體字母）以方便純化。引物分別為plyG-F（5'GGAATTCCATATGCATCACCATCACCATCACATG GAAATCCAA3'，下劃線序列為NdeⅠ酶切位點(diǎn)）、plyG-R（5'CGGAATTCTTATTTAACTTCATACCACC AACCTTT3'，下劃線序列為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）、luc-F（5'GGAATTCCATATGCATCACCATCACCATCACGGA TCCATGGAA3'，下劃線序列為NdeⅠ酶切位點(diǎn)）和luc-R（5'CGGAATTCTTACACGGCGATCTTTC3'，下劃線序列為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）。

分別以pUC19-plyG和pLenti-luc為模板，50 μL體系中使用2×TransTaq HiFi PCR SuperMixⅡ，PCR擴(kuò)增目的基因序列（plyG：94℃預(yù)變性5 min，以94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 45 s行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸 7 min，4℃恒溫；luc：94℃預(yù)變性 5 min，以94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 100 s行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min，4℃恒溫）。

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果，切膠回收目的基因片段。NdeⅠ、EcoRⅠ雙酶切目的基因和表達(dá)載體pET22b，連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans1-T1，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定，挑選陽(yáng)性克隆，質(zhì)粒分別命名為pET22b-plyG和pET22b-luc。

1.3 重組裂解酶和螢光素酶的表達(dá)及純化

將重組表達(dá)載體pET22b-plyG和pET22b-luc轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），涂于含有氨芐西林（終濃度100 μg/mL）的固體LB培養(yǎng)基平板上，倒置平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；挑取單克隆搖菌至對(duì)數(shù)期，加入IPTG（終濃度1 mmol/L），16℃低溫誘導(dǎo)24 h；誘導(dǎo)后的菌液10 000×g離心10 min，棄上清，用PBS重懸菌體，超聲波破碎處理后10 000×g離心10 min，收集上清，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后過(guò)鎳柱純化，表達(dá)及純化結(jié)果以SDS-PAGE方法檢測(cè)。用ASP3700紫外光/可見(jiàn)光微量分光光度計(jì)測(cè)定純化后酶液的蛋白含量。

1.4 酶活性檢測(cè)

將蠟樣芽孢桿菌RSVF1培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取500 μL鋪雙層BHI平板，室溫靜置10 min，吸取1.5 μL純化的PlyG酶液滴于平板上，同時(shí)以PBS緩沖液為空白對(duì)照，正置于30℃溫箱中30 min，待酶液吸收后倒置，培養(yǎng)6 h后觀察結(jié)果。

將純化的螢光素酶液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)∠♂尯蟮拿敢焊?0 μL與50 μL螢光素酶檢測(cè)試劑盒中的檢測(cè)底物混合，于Profile-1 3560（10X）ATP微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)中測(cè)得相對(duì)發(fā)光單位（RLU）。做3組重復(fù)，以測(cè)得數(shù)值的平均值來(lái)反映螢光素酶的相對(duì)活性。

1.5 平板計(jì)數(shù)法定量檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌RSVF1

將培養(yǎng)好的RSVF1菌液按1/10梯度分別稀釋至10-1、5×10-2、10-2、5×10-3、10-3、5×10-4、10-4、5×10-5、10-5，分別吸取50 μL涂布于固體LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)，同時(shí)做空白對(duì)照。次日選取菌落數(shù)為30～300的稀釋度作為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算平均值，為平板計(jì)數(shù)結(jié)果[14]。

1.6 ATP發(fā)光法定量檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌RSVF1

用PBS緩沖液配置D-螢光素/螢光素酶混合溶液，使得D-螢光素濃度為150 mg/L，螢光素酶濃度為100 mg/L[15]。取如1.5所述的9個(gè)稀釋度的菌液和細(xì)菌原液以及空白對(duì)照，按照Profile-1 3560（10X）ATP微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行：分別取50 μL加入專(zhuān)用的過(guò)濾比色杯中，比色杯下鋪一層濾紙；滴加4滴SRA試劑（非細(xì)菌細(xì)胞釋放液），用壓力器對(duì)準(zhǔn)比色杯頂端，按下壓力器把液體壓出至濾紙，重復(fù)該步驟一次；將比色杯放入3560（10×）微光度計(jì)的抽屜中，加入50 μL稀釋至1/10的PlyG酶液，等待2 min，使細(xì)菌充分被裂解；吸取50 μL D-螢光素/螢光素酶混合溶液加入比色杯，吸排混勻3次，推回抽屜，記錄儀器讀數(shù)。每個(gè)濃度梯度的樣品做3組重復(fù)，計(jì)算平均值為最終結(jié)果[16-17]。

2 結(jié)果

2.1 plyG、luc基因的擴(kuò)增和重組表達(dá)載體pET22bplyG、pET22b-luc的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增得到的plyG基因片段約740 bp，luc基因片段約1700 bp，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1。重組表達(dá)載體pET22b-plyG經(jīng)NdeⅠ、EcoRⅠ雙酶切后，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示釋放約5400和740 bp的片段（圖2）；重組表達(dá)載體pET22b-luc經(jīng)NdeⅠ、EcoRⅠ雙酶切后，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示釋放約5400和1700的片段（圖2）。

2.2 SDS-PAGE檢測(cè)PlyG和Luc的表達(dá)和純化

菌體經(jīng)PBS重懸和超聲波破碎處理，上清上樣經(jīng)電泳檢測(cè)，分別在相對(duì)分子質(zhì)量約27×103和60×103處有特異性條帶，大小與所報(bào)道的蛋白大小一致，證明目的蛋白均實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)；過(guò)鎳柱純化后，2個(gè)蛋白的條帶較單一，得到了較純的蛋白。測(cè)定蛋白濃度，PlyG為0.9 mg/mL，Luc為0.3 mg/mL（圖3）。

圖1 PCR擴(kuò)增得到的plyG、luc基因片段

2.3 裂解酶和螢光素酶活性檢測(cè)

點(diǎn)滴法驗(yàn)證PlyG活性結(jié)果如圖4，在滴有純化后的PlyG區(qū)域出現(xiàn)透亮的圓形裂解斑，直徑約5 mm。利用螢光素酶檢測(cè)試劑盒測(cè)得純化后的螢光素酶比活約為3.3×1010RLU/mg。

2.4 平板計(jì)數(shù)法與ATP生物發(fā)光法定量檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌RSVF1

3組稀釋度為10-5細(xì)菌溶液的平板計(jì)數(shù)結(jié)果分別為118、123和141，平均值為132，并由此計(jì)算其他稀釋度細(xì)菌溶液的平板計(jì)數(shù)結(jié)果。平板計(jì)數(shù)測(cè)得的細(xì)菌總數(shù)與ATP發(fā)光法測(cè)得的發(fā)光值結(jié)果見(jiàn)表1。

圖2 NdeⅠ、EcoRⅠ雙酶切重組載體pET22b-plyG和pET-luc

圖3 SDS-PAGE檢測(cè)裂解酶與螢光素酶的表達(dá)純化結(jié)果

圖4 PlyG點(diǎn)板驗(yàn)證裂解活性

2.5 ATP測(cè)定法與平板計(jì)數(shù)法的相關(guān)性

根據(jù)表1，采用10-4及以上稀釋度各組數(shù)據(jù)，以平板計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)值lg（N/cfu）（N為細(xì)菌數(shù)）為x軸，以發(fā)光值的對(duì)數(shù)值lg（N/RLU）（N為相對(duì)光單位）為y軸，做x、y散點(diǎn)圖描繪關(guān)系曲線如圖5。由圖可知，菌落總數(shù)與發(fā)光值呈顯著相關(guān)性。由表1和圖5可知，該方法最低可檢測(cè)出50 μL菌液中的約1300個(gè)菌落；當(dāng)細(xì)菌數(shù)為1300 cfu以上時(shí)，熒光發(fā)光值與細(xì)菌總數(shù)呈顯著的線性相關(guān)。

表1 蠟樣芽孢桿菌RSVF1平板菌落數(shù)與熒光發(fā)光值

圖5 菌落總數(shù)與發(fā)光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討論

近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，以炭疽桿菌噬菌體裂解酶進(jìn)行治療和檢測(cè)的研究層出不窮[3]。利用ATP生物發(fā)光對(duì)細(xì)菌進(jìn)行定量檢測(cè)的方法也已應(yīng)用于食品工業(yè)、臨床檢測(cè)等眾多領(lǐng)域[9]，Stopa等的研究，對(duì)于應(yīng)用螢光素-螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量提供了詳細(xì)的理論基礎(chǔ)與操作方法[16]。

目前以ATP生物發(fā)光法定量檢測(cè)細(xì)菌的研究往往采用細(xì)胞裂解液來(lái)裂解細(xì)菌從而釋放ATP，大多不具有特異性和專(zhuān)一性。γ噬菌體裂解酶能高效地裂解炭疽桿菌和蠟樣芽孢桿菌RSVF1，Schuch等和李曉靜等的研究對(duì)于PlyG的裂解特異性均提供了充分的實(shí)驗(yàn)證明[6，12]；螢光素-螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)因其檢測(cè)快速靈敏對(duì)于定量檢測(cè)細(xì)菌又有著不可比擬的優(yōu)勢(shì)。因此，我們采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)了噬菌體裂解酶和螢光素酶，并且在蛋白前端加入His標(biāo)簽，采用鎳柱親和層析方法純化目的蛋白，操作簡(jiǎn)便易于純化，得到了較純的酶液。以這2種酶為關(guān)鍵工具，以蠟樣芽孢桿菌RSVF1為模型，建立了熒光發(fā)光值與細(xì)菌數(shù)量之間的線性關(guān)系且二者相關(guān)性顯著。該檢測(cè)方法的檢測(cè)下限為1300 cfu，可以滿足一般檢測(cè)的需求；當(dāng)樣品所含細(xì)菌數(shù)量低于1300 cfu時(shí)，可采用簡(jiǎn)便的濃縮富集技術(shù)或多次加樣的方法，使?jié)饪s后的樣品菌落總數(shù)在有效檢測(cè)范圍以?xún)?nèi)，檢測(cè)后再通過(guò)換算得到原樣品的細(xì)菌數(shù)量。

另外，在炭疽應(yīng)急檢測(cè)方面，對(duì)芽孢的檢測(cè)尤為重要。Lee等的研究證實(shí)，對(duì)芽孢加入TSB培養(yǎng)基并進(jìn)行37℃、15 min的溫育處理，可成功地使芽孢發(fā)芽，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)芽孢的定量檢測(cè)[17]。根據(jù)該研究結(jié)果，對(duì)蠟樣芽孢桿菌RSVF1的芽孢或炭疽芽孢桿菌的芽孢做同樣的處理，同時(shí)配合裂解酶與ATP生物發(fā)光法，便能夠?qū)ρ挎哌M(jìn)行特異性定量檢測(cè)。

本研究所建立的方法是以蠟樣芽孢桿菌RSVF1為裂解對(duì)象，該菌株與炭疽桿菌一樣對(duì)PlyG敏感，因此將這套方法直接移植到對(duì)炭疽桿菌的檢測(cè)中具有較強(qiáng)的可行性。因該方法具備傳統(tǒng)ATP發(fā)光法檢測(cè)技術(shù)靈敏快速的優(yōu)點(diǎn)，在裂解細(xì)菌方面又具有特異性，在應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)或臨床定性定量檢測(cè)炭疽桿菌方面具有良好的前景和實(shí)用價(jià)值。

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