鄒 琴，楊 光，羅 紅*，宮曉紅，孫文平

(1.大連醫(yī)科大學臨床免疫與微生物教研室，遼寧 大連 116044;2.大連市中醫(yī)醫(yī)院，遼寧 大連 116013)

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pn)是社區(qū)獲得性肺炎的主要病原體，可以發(fā)生自然轉化［1］，根據其莢膜多糖抗原性的不同分為90多種血清型，其中約20種血清型對人體有致病性，可引起腦膜炎、中耳炎、鼻竇炎等多種疾?。?-3］。近年來肺炎鏈球菌耐藥的普遍性和多重耐藥趨勢逐漸升高，開發(fā)新的藥物和蛋白疫苗進行感染的治療和預防成為研究熱點［4-6］。肺炎鏈球菌自溶素(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，LytA)是肺炎鏈球菌細胞壁降解酶之一［7］，其編碼基因在不同血清型之間具有高度保守性［8-9］，編碼蛋白可以覆蓋幾乎所有血清型，而且具有免疫活性及溶菌效應，有可能成為新的疫苗靶點及抗菌藥物［10-12］。根據GenBank中收錄的肺炎鏈球菌M66菌株的lytA序列設計引物，擴增ATCC49619菌株相應基因片段，以常用的BamHⅠ、HindⅢ酶切后出現新的小片段，通過原核表達技術獲得該段基因表達的蛋白，初步研究其免疫活性，為進一步應用于疫苗及相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 肺炎鏈球菌標準菌株(ATCC49619)由衛(wèi)生部臨床檢驗中心提供。

1.1.2 主要試劑 細菌基因組DNA提取試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)，限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ、T4 DNA 連接酶、DNA Marker、蛋白Marker、DNA凝膠回收試劑盒(TaKaRa公司)，大腸埃希菌DH5α、表達菌株BL21(DE3)感受態(tài)、HRP-羊抗鼠IgG(Novagen公司)，克隆載體PGM-T、質粒提取純化試劑盒(天根生化科技有限公司)，表達載體PET-32α(本實驗室保存)，化學發(fā)光底物Super-Signal ECL(Pierce公司)，純化蛋白LytA'免疫血清為本實驗室自制(抗體效價1∶32)。

1.2 方法

1.2.1 肺炎鏈球菌自溶素基因擴增、克隆 根據GenBank中肺炎鏈球菌M66菌株lytA基因全序列(FN549899.1)，設計上下游引物:P1為 5'-GGGGGATCCATGGAAATTAATGTGAGT-3'，P2 為5'-GGGAAGCTTTTTTACTGTAATCAAGCCATC-3'，斜體部分為引入的BamHⅠ和HindⅢ酶切位點，引物由 TaKaRa公司合成。提取肺炎鏈球菌(ATCC49619)基因組DNA，PCR反應擴增目的片段(95℃ 4 min;95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min、30個循環(huán);72℃ 7 min)，反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。切膠回收，構建克隆質粒PGM-T/lytA'，測序由TaKaRa公司完成。

1.2.2 重組表達質粒的構建與鑒定 測序正確的克隆質粒用BamHⅠ、HindⅢI雙酶切，將出現的約500 bp小片段切膠回收，與pET-32α(+)載體酶切后的片段16℃過夜連接，轉化至感受態(tài)細胞E.coli DH5α，于LB/Amp平板上挑取單個克隆培養(yǎng)后，抽提質粒進行雙酶切鑒定并再次測序，構建重組表達質粒pET-32α(+)/lytA'。

1.2.3 重組表達質粒的誘導表達與純化 將鑒定正確的重組表達質粒轉化至感受態(tài)細胞E.coli BL21(DE3)，涂布于LB/Amp平板，篩選陽性克隆接種于LB/Amp液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至對數生長期(A600值為0.6 ～0.8)，加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG，25℃誘導4 h;4℃離心收集菌體，加入裂解液超聲破碎，4℃離心收集上清和沉淀，分別進行SDS-PAGE電泳。用透析袋等電點洗脫法回收純化蛋白LytA'并定量分析，保存于－80℃冰箱。

1.2.4 免疫血清制備 取6只BALB/c小鼠，雌雄各半，18～20 g，5～6周齡(大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供)。LytA'免疫血清制備程序:首次免疫每只小鼠腹股溝皮下注射LytA'0.2 mg;分別于第14及第21天加強免疫，每只皮下注射0.2 mg。末次免疫后第5天摘取小鼠眼球進行采血，分離血清，與純化蛋白進行雙向免疫擴散試驗，測定抗體效價后于－20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 表達產物 Western blot分析 將純化的LytA'蛋白按常規(guī)方法進行SDS-PAGE電泳后轉到NC膜上，以上述免疫血清作為一抗，HRP-羊抗鼠IgG為二抗，ECL顯影。

2 結果與分析

2.1 肺炎鏈球菌自溶素基因的擴增、克隆

lytA全序列擴增產物約950 bp處可見特異性條帶(圖1)，與預期結果(956 bp)相符。重組克隆質粒PGM-T/lytA測序結果與GenBank中M66菌株的基因序列符合率為98%，不同之處主要位于444～466 bp，肺炎鏈球菌ATCC49619菌株新增了一個BamHⅠ酶切位點(GGATCC)，PGM-T/lytA經BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后出現3條帶(圖2)。

圖1 肺炎鏈球菌lytA的PCR擴增電泳圖Fig.1 PCR amplification of lytA of S.pn

圖2 重組質粒PGM-T/lytA酶切圖Fig.2 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid PGM-T/lytA

2.2 重組表達載體的構建及鑒定

構建的小片段自溶素的重組表達質粒pET-32α(+)/lytA'經 BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后顯示約500 bp目的片段。序列測定結果顯示該片段基因與肺炎鏈球菌ATCC49619菌株的克隆質粒PGMT/lytA相應部分符合率為100%，未出現變異。

2.3 重組表達質粒誘導表達與純化

小片段自溶素的重組表達質粒 pET-32α(+)/lytA'經IPTG誘導后，在相對分子質量(Mr)約20 ku處有明顯的蛋白表達條帶(圖3)，該蛋白主要以可溶性上清形式存在，用等電點洗脫法純化后電泳顯示為單一蛋白條帶(圖4)。

2.4 免疫血清制備

LytA'免疫小鼠血清抗體效價為1∶32，所獲得的目的蛋白具有較好的免疫原性。

2.5 Western blot分析

LytA'與相應抗體發(fā)生特異性結合，相對分子質量約20 ku處出現明顯印跡反應帶(圖5)，該目的蛋白具有較好的抗體結合活性。

圖3 重組表達質粒pET-32α(+)/lytA'的IPTG誘導結果Fig.3 Analysis of the products expressed by pET-32α(+)/lytA'with IPTG induction

圖4 純化蛋白LytA'的SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE profile of purified protein LytA'

3 討論

肺炎鏈球菌自溶素是肺炎鏈球菌的主要毒力因子之一，在不同血清型的肺炎鏈球菌中具有高度保守性，這一特性作為疫苗靶點可以預防不同血清型引起的感染，而且作為蛋白質，可以誘導T細胞依賴性免疫應答，產生免疫記憶，克服了多糖疫苗的局限性［13］。通過基因工程技術獲取重組蛋白，不但可以大量獲得而且便于分子結構的修飾改良，本研究證明了肺炎鏈球菌自溶素LytA其中的一個小片段可以通過原核表達技術獲得，初步證明具有免疫原性和抗體結合活性，為進一步應用于血清學診斷和疫苗靶點研究奠定基礎。

GenBank中尚未收錄ATCC49619菌株的自溶素序列，本研究參照已公布的肺炎鏈球菌M66菌株自溶素序列(FN549899.1)設計引物，成功擴增克隆了肺炎鏈球菌ATCC49619菌株的956 bp自溶素全片段，所構建的克隆質粒測序結果和M66菌株基因序列同源性為98%，證明了lytA基因序列的保守性。堿基變異的區(qū)域主要集中在444～466 bp之間，而且在此區(qū)域內堿基的變異恰巧形成了一個BamHⅠ酶切位點，這就提示如果利用ATCC49619菌株表達整段的自溶素蛋白，就需要避免用BamHⅠ酶進行克隆質粒的酶切。本研究中利用BamHⅠ酶切位點來構建小片段自溶素重組表達質粒，成功表達出分子量約20 ku的自溶素蛋白片段，相比于全段rLytA(分子量約56 ku)，小分子量蛋白片段用于藥物及疫苗靶點可能更具有優(yōu)勢，而且和抗體結合時有利于減少空間位阻，通過免疫小鼠及Western blot實驗證明該蛋白具有免疫原性和抗體結合活性，具有應用于疫苗及血清學診斷的可能性。通常以pET32α(+)載體構建的表達質粒，表達出來的是一種融合蛋白，在目的蛋白的N末端融合有分子量約20 ku的硫氧還原蛋白，本實驗中的目的蛋白雖然分子量約為20 ku，但所構建的表達質粒經過測序，證實為自溶素的片段，并非是硫氧還原蛋白，具有不必切除硫氧還原蛋白，直接應用于相關研究的優(yōu)勢。

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