溫志新，孫永欣，李亞潔，都興范

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大連生物技術(shù)研究所，遼寧大連 116024）

麥飯石是一種高效無(wú)毒的藥物礦石，含有多種對(duì)生物生長(zhǎng)發(fā)育有益的常量元素、微量元素以及被稱作動(dòng)物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的稀土元素和微量氨基酸（王銀葉等，2003）。麥飯石因具有礦化性、吸附性，現(xiàn)已廣泛用于礦化飲用水生產(chǎn)，并且可以有效捕獲水體中重金屬和細(xì)菌（王維清等，2005；王蘇新，2003）。在飼料中添加麥飯石比無(wú)機(jī)鹽能更好地補(bǔ)充某些營(yíng)養(yǎng)元素的不足和缺乏，從而促進(jìn)魚蝦的生長(zhǎng)發(fā)育（董志巖等，1997）。麥飯石作為載體固定益生菌擴(kuò)大了麥飯石的使用范圍，該方法避免了微生物在水體中懸浮流失并保證細(xì)胞酶活性不受影響，并且價(jià)格便宜且制備過(guò)程簡(jiǎn)單，現(xiàn)已廣泛用于水質(zhì)凈化（張躍峰，2006）。

由于刺參攝食的特殊性，將益生菌直接添加到飼料中會(huì)造成其在水體中散失。因此，本試驗(yàn)利用麥飯石吸附性對(duì)枯草芽孢桿菌固定制備成麥飯石載體枯草芽孢桿菌（下稱載菌麥飯石），添加到刺參飼料中，測(cè)定其對(duì)刺參生長(zhǎng)和抗病力的影響及對(duì)刺參養(yǎng)殖廢水氨氮和亞硝酸鹽清除能力，為益生菌在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用及合理開(kāi)發(fā)麥飯石資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 麥飯石載體枯草芽孢桿菌制備 麥飯石微粉（200目），產(chǎn)于遼寧阜新。飼料級(jí)枯草芽孢桿菌菌粉購(gòu)自滄州華雨藥業(yè)有限公司。

1.1.1 枯草芽孢桿菌菌液制備 取少量菌粉 （約1接種環(huán)）接種于枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基（20 g葡萄糖+15 g蛋白胨+0.5 g牛肉膏溶于1 L海水，pH 7.5）中，于搖床中培養(yǎng)（36 ℃、140 r/min）14 h，菌液濃度達(dá)到108個(gè)/mL。

1.1.2 菌體細(xì)胞固定和成品制備 每1 L菌液中加入250 g麥飯石微粉，室溫170 r/min振蕩1.5 h后靜置30 min，棄上清液，沉淀于烘箱中（60℃）烘干后用粉碎機(jī)粉碎，顆粒粒度≤100目。

1.2 試驗(yàn)刺參 試驗(yàn)用刺參為大連瓦房店某大型刺參育苗場(chǎng)同批刺參幼體（小白點(diǎn)），于養(yǎng)殖場(chǎng)室內(nèi)育苗池（體積為25 m3）內(nèi)工廠化養(yǎng)殖，每天更換1/3體積海水，每周全換水一次。每天下午投喂飼料，水溫在13～16℃，鹽度保持在28‰ ～31‰。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 養(yǎng)殖試驗(yàn) 養(yǎng)殖試驗(yàn)分4個(gè)試驗(yàn)組，分別是對(duì)照組、枯草芽孢桿菌組、麥飯石組和載菌麥飯石組，每個(gè)試驗(yàn)組為一個(gè)育苗池的全部幼體（約上億個(gè)體），養(yǎng)殖試驗(yàn)共60 d，試驗(yàn)結(jié)束稱量體重。

1.3.2 試驗(yàn)飼料 分別在基礎(chǔ)飼料中添加5%枯草芽孢桿菌、5%麥飯石、5%載菌麥飯石。各組飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 各組刺參飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平 %

1.3.3 攻毒試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)束后，每組取30只刺參個(gè)體，用燦爛弧菌（Vibrio splendidus，本研究所保存菌種，密度≥1012個(gè)/mL）和假交替單胞菌（Pseudoalteromonas nigrifaciens，荷蘭真菌生物多樣性中心，菌種號(hào)：NCCB 100134，密度≥1012個(gè)/mL）混合菌液對(duì)刺參體腔注射，每天換水，少量投喂，15 d后統(tǒng)計(jì)存活率。

1.3.4 不同飼料添加成分對(duì)養(yǎng)殖廢水中氨氮、亞硝酸鹽的影響 于30 L刺參養(yǎng)殖廢水中分別投入150 mg/kg枯草芽孢桿菌粉、麥飯石粉和載菌麥飯石，并設(shè)空白對(duì)照組。分別于試驗(yàn)0、1、3、7 d取樣測(cè)定氨氮和亞硝酸鹽。期間不充氣，添加的劑量參考麥飯石凈化海參圈的常用量。

1.3.5 水質(zhì)測(cè)定方法 用奈氏試劑法測(cè)定氨氮；用重氮-偶氮比色法測(cè)定亞硝酸鹽。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行Duncan’s多重比較，存活率采用X2獨(dú)立性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥飯石載體枯草芽孢桿菌對(duì)刺參體重的影響 經(jīng)過(guò)60 d養(yǎng)殖，各組刺參幼體體重如表2所示，飼料中添加枯草芽孢桿菌組刺參平均體重低于對(duì)照組，麥飯石組和載菌麥飯石組平均體重分別比對(duì)照組高18.46%和22.80%。

表2 各試驗(yàn)組刺參體重

2.2 攻毒試驗(yàn) 由表3可見(jiàn)，各試驗(yàn)組刺參存活率均高于對(duì)照組，單獨(dú)使用芽孢桿菌和麥飯石并未顯著提高攻毒存活率，只有載菌麥飯石組存活率較對(duì)照組提高66%（P＜0.05）。

表3 攻毒后各組刺參存活率

2.3 麥飯石載體枯草芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)殖廢水中氨氮的影響 經(jīng)過(guò)7 d的4次測(cè)定，對(duì)照組、芽孢桿菌組和麥飯石組水體氨氮值不斷上升，芽孢桿菌組始終高于對(duì)照組，麥飯石組始終低于對(duì)照組，并在第3天時(shí)差異顯著（P＜0.05）；芽孢桿菌經(jīng)麥飯石固定后，其對(duì)水體氨氮去除效果雖然在第1天和第3天略差于麥飯石，但仍優(yōu)于對(duì)照組和芽孢桿菌組，而在第7天時(shí)，氨氮值最低，且顯著低于其他各組（P＜0.05）。單獨(dú)使用枯草芽孢桿菌對(duì)水體氨氮未表現(xiàn)出去除能力，反而造成氨氮值升高（圖 1）。

圖1 麥飯石載體枯草芽孢桿菌去除水體氨氮效果

2.4 麥飯石載體枯草芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)殖廢水中亞硝酸鹽的影響 在4次測(cè)定中，麥飯石在第1天時(shí)對(duì)水體中亞硝酸鹽去除效果最好，顯著低于對(duì)照組（P ＜ 0.05），在第 3、7天時(shí)，載菌麥飯石對(duì)水體亞硝酸鹽去除效果最佳，低于其他組，且顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。單獨(dú)使用枯草芽孢桿菌在前期會(huì)造成亞硝酸鹽值升高，在第7天測(cè)定時(shí)才表現(xiàn)出降解能力（圖2）。

圖2 麥飯石載體枯草芽孢桿菌去除水體亞硝酸鹽效果

3 討論

在水產(chǎn)動(dòng)物腸道中，枯草芽孢桿菌孢子活化后消耗大量氧氣，維持腸道厭氧環(huán)境，抑制致病菌生長(zhǎng)，并能產(chǎn)生抗弧菌（黃汝添等，2006）和酵母菌（謝海平，2003）等活性物質(zhì)，對(duì)魚類嗜水氣單胞菌有強(qiáng)烈抑殺作用（潘曉藝等，2007）。此外，枯草芽孢桿菌能通過(guò)合成維生素和輔酶因子或促進(jìn)酶促反應(yīng)提高腸道消化酶活性（Gatesoupe，1999）。本試驗(yàn)中，刺參攝食添加枯草芽孢桿菌的飼料未表現(xiàn)出高生長(zhǎng)率和抗病力，原因可能是刺參攝食緩慢，芽孢桿菌被攝食之前已大部分散失，從而未被刺參有效利用。這也是益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)際應(yīng)用中的局限。

麥飯石作為飼料添加劑能提高水產(chǎn)動(dòng)物增重率和成活率。董志巖等（1997）在幼鰻飼料中添加2%麥飯石，鰻魚增重率提高7.88%，飼料報(bào)酬提高6.21%，成活率提高4.95%。趙元鳳等（2001）研究報(bào)道，在鮑魚基礎(chǔ)飼料中添加1%麥飯石能顯著提高皺紋盤鮑（Haliotis discus hannat Ino）平均增重率。在本試驗(yàn)的刺參飼料中添加5%麥飯石，刺參增重率提高18.46%，攻毒存活率提高20%，這是因?yàn)辂滐埵缓笄萆L(zhǎng)所必需的鐵、硒、鈷等十幾種微量元素，并且麥飯石可使動(dòng)物血中的γ-球蛋白增加，T淋巴細(xì)胞數(shù)目增多，從而使機(jī)體的免疫能力增強(qiáng)（任道泉等，1998）。

由于麥飯石呈多孔性、海綿狀結(jié)構(gòu)，具有良好的物理吸附性能，因此可以作為細(xì)菌吸附載體，對(duì)目的微生物固定，防止有益菌在水體中散失。本試驗(yàn)利用麥飯石對(duì)枯草芽孢桿菌的吸附性對(duì)其固定，結(jié)果表明，該方法制備的載菌麥飯石促進(jìn)刺參增重和抗病力的效果優(yōu)于二者單獨(dú)使用。由于二者的協(xié)同效果，不僅利用麥飯石補(bǔ)充了礦物質(zhì)元素，還利用枯草芽孢桿菌產(chǎn)生胞外消化酶和抗菌物質(zhì)等，因此不論在增重率和抗病力方面均優(yōu)于芽孢桿菌或麥飯石單獨(dú)使用。

養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝酸鹽濃度是影響水產(chǎn)動(dòng)物正常生長(zhǎng)和水質(zhì)的關(guān)鍵因素，在水族箱充氣養(yǎng)殖過(guò)程中，水體氨氮含量較少，而即使日換水量達(dá)到1/3，亞硝酸鹽濃度仍較高（姚雪梅等，2007）。糙海參（Holothuria scabra）長(zhǎng)期處于較高的亞硝酸鹽濃度，食欲下降，排便量減少，當(dāng)亞硝酸鹽濃度超過(guò)1.8 mg/L時(shí)，海參發(fā)生吐腸。解剖腸道也發(fā)現(xiàn)腸道壁變硬，失去彈性。雖然海參沒(méi)有死亡，但明顯減重（姚雪梅等，2007）。由于在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，進(jìn)入人工養(yǎng)殖系統(tǒng)的氮素近90%源于投入餌料（Lorenzen等，1997），因此飼料中添加吸附或降解氨氮和亞硝酸鹽的物質(zhì)可在源頭上直接降低水質(zhì)污染并提高餌料利用率?？莶菅挎邨U菌能明顯降低養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝酸鹽濃度，改善養(yǎng)殖水質(zhì)（Liu和 Han，2004）。但本試驗(yàn)中，枯草芽孢桿菌對(duì)水體氨氮和亞硝酸鹽未表現(xiàn)出清除作用，這與駱?biāo)囄模?009）研究結(jié)果一致，原因可能與水體溶氧不足、水溫較低以及水體缺乏藻類有關(guān)。此外，枯草芽孢桿菌屬嚴(yán)格需氧微生物，大量芽孢桿菌迅速消耗氧氣，導(dǎo)致厭氧菌增多，由于厭氧菌對(duì)氮的同化少，故產(chǎn)生更多的NH3（Reddy等，1996）。而亞硝酸鹽是水體氨氮轉(zhuǎn)化成硝酸鹽的中間產(chǎn)物，是在亞硝化菌和氧氣作用下完成的，亞硝酸鹽最終經(jīng)過(guò)硝化細(xì)菌作用轉(zhuǎn)變?yōu)橄跛猁}，但硝化細(xì)菌繁殖速度很慢，大約20 h一代，因此水體中亞硝酸鹽易升高（楊鏗等，2008）。本試驗(yàn)芽孢桿菌組亞硝酸鹽濃度前期高于對(duì)照組，之后才降低，分析可能是受到水體氨氮和溶氧的雙重影響，隨著氨氮濃度升高，水體溶氧快速被異養(yǎng)菌利用，接著被大量轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽。因此，亞硝酸鹽濃度持續(xù)上升。最后，芽孢桿菌組氨氮值異常升高，而亞硝酸鹽有所降低，很可能是溶氧不足，導(dǎo)致亞硝酸鹽又轉(zhuǎn)變成氨氮（Keller等，2002）。因此，使用芽孢桿菌時(shí)必須保證充足的溶氧。

本試驗(yàn)中麥飯石對(duì)水質(zhì)凈化作用較為明顯，短期（3 d和1 d）對(duì)水體中氨氮和亞硝酸鹽去除效果迅速，這與其顯著的吸附性能有關(guān) （石玉臣等，2000）。而載菌麥飯石對(duì)水質(zhì)的凈化作用為長(zhǎng)期對(duì)水體氨氮（7 d）和亞硝酸鹽（3 d后）的清除能力表現(xiàn)出較佳的效果，這與張躍峰（2006）試驗(yàn)結(jié)果一致，分析認(rèn)為是枯草芽孢桿菌發(fā)揮了作用。麥飯石本身攜帶有大量氧氣，并且能吸附水體中氨氮和亞硝酸鹽，而枯草芽孢桿菌在有麥飯石提供的氧氣存在時(shí)，發(fā)揮較好的氨氮和亞硝酸鹽分解能力，因此在本試驗(yàn)中后期表現(xiàn)出比麥飯石更好的水質(zhì)改善作用。

4 結(jié)論

枯草芽孢桿菌經(jīng)過(guò)麥飯石固定后，作為飼料添加劑按5%添加能明顯提高刺參幼體生長(zhǎng)性能和抗病力，所添加成分可在3～7 d顯著降低水體中的氨氮和亞硝酸鹽濃度，從而降低飼料給養(yǎng)殖水體帶來(lái)的環(huán)境壓力。

[1]董志巖，童斌，繆伏榮，等.鰻魚飼料添加麥飯石的試驗(yàn)[J].飼料研究，1997，12：9 ～ 10.

[2]黃汝添，謝海平，陸勇軍，等.枯草芽孢桿菌Bs-1拮抗溶藻弧菌的特性[J].熱帶海洋學(xué)報(bào)，2006，25（4）：51 ～ 55.

[3]駱?biāo)囄?刺參有益菌制劑的研制與應(yīng)用研究：[碩士學(xué)位論文][D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2009.

[4]潘曉藝，沈錦玉，余旭平，等.水產(chǎn)養(yǎng)殖中枯草芽孢桿菌的分子鑒定[J].水生生物學(xué)報(bào)，2007，31（1）：139 ～ 141.

[5]任道泉，程軍，郭宏偉.麥飯石在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中的作用[J].塔里木農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，10（2）：65 ～ 67.

[6]石玉臣，柴永昌，李壽山.山東幾處典型麥飯石礦床的地質(zhì)特征及其主要物化性能[J].山東地質(zhì)，2000，16（2）：17 ～ 23.

[7]王蘇新.麥飯石特性及作用分析[J].江蘇陶瓷，2003，36（1）：1 ～ 2.

[8]王維清，馮啟明，袁昌來(lái).一種新型的無(wú)機(jī)抗菌劑載體—麥飯石[J].中國(guó)礦業(yè)，2005，14（1）：41 ～ 44.

[9]王銀葉，馬育蓮，史艷嬌.活性麥飯石結(jié)構(gòu)的探討及應(yīng)用[J].天津化工，2003，17（2）：7 ～ 9.

[10]謝海平，黃暉，黃登峰，等.海洋枯草芽孢桿菌Bs—1產(chǎn)生多種抗真菌活性物質(zhì)[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，42（3）：122 ～ 123.

[11]楊鏗，冷加華，文國(guó)，等.對(duì)蝦養(yǎng)殖中后期亞硝酸鹽過(guò)高問(wèn)題的處理與預(yù)防[J].中國(guó)水產(chǎn)，2008，8：53 ～ 55.

[12]姚雪梅，王紅勇，邢少雷，等.不同水溫和水質(zhì)理化因子對(duì)糙海參攝食、生長(zhǎng)影響研究[J].水產(chǎn)科學(xué)，2007，26（5）：292 ～ 295.

[13]張躍峰.固定化有益微生物技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的初步研究：[碩士學(xué)位論文][D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2006.

[14]趙元鳳，呂景才，楊越，等.麥飯石、稀土作為鯉魚、皺紋盤鮑飼料添加劑研究[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，20（4）：287 ～ 291.

[15]Gatesoupe F J.The use of probiotics in aquaculture[J].Aquaculture，1999，180：147 ～ 165.

[16]Keller J，Yuan Z，Blackall L L.Integrating process engineering and microbiology tools to advance activated sludge wastewater treatment research and development reviews in environmental[J].Sci&Biotechnol，2002，1：83 ～ 97.

[17]Liu F，Han W Y.Reuse strategy of wastewater in prawn nursery by microbial remediation[J].Aquaculture，2004，230（1-4）：281 ～ 296.

[18]Lorenzen K，Struve J，Cowan V J.Impact of farming intensity and water management on nitrogen dynamics in intensive pond culture：a mathematical model applied to Thai commercial shrimp farms[J].Aquaculture Res，1997，28：493～507.

[19]Reddy K R，F(xiàn)isher M M，Ivanoff D.Resuspension and diffusive flux of nitrogen and phosphorus in a hypereutrophic lake[J].J Environ Qual，1996，25：363～371.■