王 茜，孫海彥，方 哲，陳 江，王春吉，王冬梅

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶海洋生物資源利用研究中心，海南?？?571101）

方斑東風(fēng)螺（Babylonia areolata）主要分布于我國東南沿海和東南亞諸國亞熱帶及熱帶沿海，其味道鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高，隨著規(guī)?；斯び绾宛B(yǎng)殖技術(shù)的成功，我國東風(fēng)螺養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展前景良好。但目前東風(fēng)螺的養(yǎng)殖主要采用小雜魚為餌料，存在餌料供應(yīng)不穩(wěn)定、養(yǎng)殖水體污染及致病性細(xì)菌侵染等問題，直接制約了東風(fēng)螺養(yǎng)殖的規(guī)模和可持續(xù)發(fā)展。

飼用微生物制劑是利用特殊工藝將對(duì)動(dòng)物有益的微生物制成的活菌劑，其作用之一是能夠刺激動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，提高其免疫力。本試驗(yàn)以芽孢桿菌為配合飼料微生物添加劑，研究地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺抗氧化酶活性的影響，為生產(chǎn)免疫功能性東風(fēng)螺配合飼料提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料 基礎(chǔ)飼料配制以魚粉、豆粕為主要的蛋白源，魚油為主要的脂肪源，α-淀粉為飼料黏合劑，飼料組成見表1。芽孢桿菌粉由本所提供，含菌量為0.2%。以不添加芽孢桿菌的基礎(chǔ)飼料作為對(duì)照（C組），試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼料中分別添加0.5%的枯草芽孢桿菌粉和0.5%的地衣芽孢桿菌粉，分別編號(hào)為K組和D組。將固體原料粉碎后過80目篩，然后按照配方稱取原料，用飼料混合機(jī)混合均勻。按照配方加入魚油和水混合揉成面團(tuán)狀，稱重記錄，再按照估算的日投喂量分成小塊，裝入封口袋。為保證飼料成分一致，所有試驗(yàn)飼料一次制備，保存于-20℃，投喂前使之解凍至室溫。

表1 試驗(yàn)飼料組成 %

1.2 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)于2012年12月至2013年2月在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所海洋動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。方斑東風(fēng)螺幼螺由瓊海市長坡鎮(zhèn)昌旺東風(fēng)螺養(yǎng)殖場(chǎng)提供，選擇同一批螺苗，暫養(yǎng)馴化1周，停止投喂2 d后，挑選活力好、個(gè)體規(guī)格相近，體重為（1.9±0.2）g的個(gè)體作為試驗(yàn)材料，隨機(jī)分配至對(duì)照組和2個(gè)試驗(yàn)組，每組3個(gè)重復(fù)。在37 cm×25 cm×30 cm的水族箱中，鋪一層60目絹布，布上鋪3～4 cm的細(xì)沙，加入天然海水，采用循環(huán)水飼養(yǎng)。養(yǎng)殖期間海水鹽度為33‰，pH 為 7.6，水溫為（23±1.2）℃，隔天投餌一次，1 h后清除殘餌，養(yǎng)殖60 d后取樣。

1.3 樣品處理與測(cè)定 每組中各隨機(jī)選取3只，共9只，每只螺組織單獨(dú)測(cè)定。每次取樣后立即于冰上解剖分離出肝胰臟，用預(yù)冷的生理鹽水清洗，再用濾紙吸干，準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量體積比加入9倍的生理鹽水制成 10%的組織勻漿，4℃、2500 r/min離心 10 min，取上清液用于酶活測(cè)定，所有樣品在24 h內(nèi)測(cè)定完畢。

組織勻漿粗提液蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。超氧化物歧化酶 （SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行。酶活力單位定義如下：

SOD活力單位：每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量，為一個(gè) SOD活力單位（U）。

CAT活力單位：每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol的 H2O2的量為一個(gè)活力單位（U）。

POD活力單位：在37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 μg的底物的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)均以 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用單因素方差分析法 （ANOVA）進(jìn)行比較，P≤0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺肝胰臟中SOD活力的影響 由圖1可見，C組SOD平均活力為（24.67±4.3）U/mg prot，K 組和 D 組分別為（23.38±2.05）U/mg prot和（17.05±3.22）U/mg prot。 經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，K組與C組差異不顯著（P＞0.05），說明飼料中添加枯草芽孢桿菌不影響方斑東風(fēng)螺肝胰臟組織中SOD的活力；而D組SOD的活力相對(duì)于空白對(duì)照的C組降低了30.89%，差異極顯著（P＜0.01），說明飼料中添加地衣芽孢桿菌可引起方斑東風(fēng)螺肝胰臟組織中SOD的活力降低。

圖1 芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺肝胰臟中SOD活力的影響

2.2 芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺肝胰臟中CAT活力的影響 由圖2可見，C、K、D組CAT平均活力分別為（0.91±0.46）、（0.89±0.44）U/mg prot和（0.27±0.35）U/mg prot。地衣芽孢桿菌顯著降低了方斑東風(fēng)螺肝胰臟中CAT的活力（P＜0.05），比對(duì)照組降低了70.33%；添加枯草芽孢桿菌的K組方斑東風(fēng)螺肝胰臟中CAT的活力與對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05）。說明飼料中添加枯草芽孢桿菌不影響方斑東風(fēng)螺肝胰臟組織中CAT的活力，添加地衣芽孢桿菌可引起方斑東風(fēng)螺肝胰臟組織中CAT的活力降低。

圖2 芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺肝胰臟中CAT活力的影響

2.3 芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺肝胰臟中POD活力的影響 由圖3可見，與SOD和CAT不同，飼料中添加枯草芽孢桿菌的K組方斑東風(fēng)螺肝胰臟中 POD 的平均活力為（4.2±0.78）U/mg prot，而對(duì)照組為（3.27±0.49）U/mg prot，與對(duì)照組的活力相比提高了28.44%（P＜0.05）；添加地衣芽孢桿菌的D組方斑東風(fēng)螺肝胰臟中POD的活力為（3.41±0.62）U/mg prot，與對(duì)照組相比無顯著變化（P＞0.05）。說明飼料中添加枯草芽孢桿菌可引起方斑東風(fēng)螺肝胰臟組織中CAT的活力升高，添加地衣芽孢桿菌不影響方斑東風(fēng)螺肝胰臟組織中POD的活力。

圖3 芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺肝胰臟中POD活力的影響

3 討論

方斑東風(fēng)螺屬于無脊椎動(dòng)物的新腹足類，僅有非特異性免疫系統(tǒng)，可分為體液免疫和細(xì)胞免疫兩個(gè)部分，由血細(xì)胞分泌的抗氧化酶，被認(rèn)為是體液免疫的重要組成部分（Ordasd等，2000）。動(dòng)物體由于呼吸爆發(fā)而產(chǎn)生活性氧，一方面具有殺菌功能，另一方面也會(huì)對(duì)機(jī)體自身造成傷害，而抗氧化酶在清除自由基的過程中發(fā)揮重要的作用，從而能防止機(jī)體受到氧化破壞。SOD、CAT、POD是機(jī)體分解H2O2及清除等自由基的重要酶類。已有研究表明，肝胰臟是東風(fēng)螺對(duì)抗饑餓、污染等脅迫環(huán)境的重要器官，肝胰臟抗氧化酶的活性水平與免疫防御能力密切相關(guān)（薛明等，2010）。

芽孢桿菌作為微生態(tài)制劑，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中已廣泛使用，并取得了較好的效果。在魚、蝦、貝等水產(chǎn)動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌可以提高其免疫器官的抗氧化能力和免疫功能。對(duì)草魚的研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加枯草芽孢桿菌能顯著提高草魚血清和肝胰臟中SOD和CAT的活性 （沈文英等，2011）。而在飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清SOD的活性無顯著影響 （王玲等，2011）。本研究以芽孢桿菌作為飼料添加劑，對(duì)方斑東風(fēng)螺肝胰臟組織中SOD、CAT和POD三種酶活性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在飼料中添加0.5%的枯草芽孢桿菌添加劑，對(duì)東風(fēng)螺肝胰臟組織中SOD和CAT的活性無顯著影響，但能顯著提高POD的活性；而飼料中添加0.5%地衣芽孢桿菌則顯著降低了東風(fēng)螺肝胰臟組織中SOD和CAT的活性，對(duì)POD的活性無顯著影響。雖然芽孢桿菌作為飼料添加劑已被廣泛應(yīng)用于禽畜和水產(chǎn)動(dòng)物的養(yǎng)殖，但由于養(yǎng)殖對(duì)象自身的特性不同，應(yīng)用效果和適宜添加量也不同。根據(jù)本試驗(yàn)的結(jié)果，飼料中添加0.5%的枯草芽孢桿菌可提高方斑東風(fēng)螺的非特異性免疫力，反之，飼料中添加0.5%的地衣芽孢桿菌可能會(huì)降低方斑東風(fēng)螺的非特異性免疫力。

[1]沈文英，李衛(wèi)芬，梁權(quán)，等.飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)草魚生長性能、免疫和抗氧化能力的影響[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011，23（5）：881 ～ 886.

[2]王玲，張春曉，孫鳴，等.飼料中添加枯草芽孢桿菌（CGMCC No.3755）對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長性能和非特異性免疫力的影響[J].飼料工業(yè)，2011，4（32）：47～51.

[3]薛明，柯才煥，王德祥，等.饑餓及恢復(fù)生長對(duì)方斑東風(fēng)螺抗氧化體系的影響[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2010，2（17）：281 ～ 288.

[4]Ordas M C，Ordas A，Beloso C，et al.Immune parameters in carpet shell clams naturally infected with Perkinsus atlanticus[J].Fish&Shellfish Immunology，2000，10：597 ～ 609.■