劉 洋 李繼昌

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

多粘菌素在1947年發(fā)現(xiàn)于多粘芽孢桿菌多個(gè)亞種的培養(yǎng)液中，它能有效治療革蘭氏陰性菌的感染，特別是對(duì)銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌有特效（Fagalas和 Kasiakou，2006）。 此外，多粘菌素還具有抗內(nèi)毒素作用，作為飼料添加劑還可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)（陳杖榴等，2002）。20世紀(jì)80年代不斷有報(bào)道指出多粘菌素存在腎毒性和神經(jīng)毒性，在隨后的20年里，多粘菌素除用于多重耐藥革蘭氏陰性菌感染的纖維囊性肺炎的治療外，其使用逐漸被新的抗生素所替代。近10年內(nèi)，多重耐藥革蘭氏陰性細(xì)菌的產(chǎn)生以及有效的抗生素的缺乏使得多粘菌素再次進(jìn)入人們的視野，其臨床應(yīng)用價(jià)值得到重新認(rèn)識(shí)和再評(píng)價(jià)。然而，其神經(jīng)毒性仍然是亟待解決的問(wèn)題（代重山等，2012）。因此，本研究通過(guò)采用PC12細(xì)胞系建立硫酸粘菌素誘導(dǎo)神經(jīng)毒性體外模型，為進(jìn)一步篩選具有對(duì)抗硫酸粘菌素神經(jīng)毒性的藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 藥品與儀器 大鼠腎上腺嗜鉻骨髓瘤（PC12）細(xì)胞 （來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）；DMEM 干粉培養(yǎng)基 （Gibco）、 胎牛血清（FBS，Hyclone）、二甲基亞砜（DMSO，Sigma）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，Sigma）、硫酸粘菌素（Sigma）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶（corning）、96 孔板（Corning）、凍存管（Corning）、二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、FA2004N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、iMarkTM型酶標(biāo)檢測(cè)儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每1～2 d換液1次，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，1∶2～1∶3分瓶傳代。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)處理。

1.3 繪制不同細(xì)胞密度的生長(zhǎng)曲線 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基分別稀釋至 1×104、5×104、1×105、5×105個(gè)/mL 和 1×106個(gè)/mL，每孔 100 μL接種于 96孔板中，每個(gè)濃度組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔，并設(shè)加培養(yǎng)液的空白對(duì)照組。共接5塊板，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別于 4、8、12、24、36 h 用 MTT 比色法測(cè)定吸光度值 （A值）。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，繪制不同濃度PC12細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞吹打成單個(gè)懸浮細(xì)胞后，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)細(xì)胞濃度后加入96孔板，置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入1 mg/mL MTT 溶液 100 μL。 置于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min使藍(lán)色結(jié)晶充分溶解，上酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔吸光度值（490 nm）。細(xì)胞存活率以與對(duì)照組相比的百分?jǐn)?shù)表示。

細(xì)胞存活率/%=（試驗(yàn)組吸光度-空白對(duì)照組吸光度）/（正常對(duì)照組吸光度-空白對(duì)照組吸光度）×100。

1.5 硫酸粘菌素造模濃度及作用時(shí)間的篩選試驗(yàn)分為正常對(duì)照組和不同濃度硫酸粘菌素組（62.5、125、250、500、1000 μg/mL），同時(shí)每組均設(shè)含培養(yǎng)液的空白對(duì)照組。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整為1×105個(gè)/mL濃度后接種于96孔板，每孔100 μL，置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS清洗3次，分別加入100 μL濃度分別為 62.5、125、250、500、1000 μg/mL 用 DMEM培養(yǎng)液配制的硫酸粘菌素，以無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液做空白對(duì)照，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別作用 2、4、8、12、24、48 h 后， 采用 MTT 比色法測(cè)定各組A值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS11.5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同接種細(xì)胞密度的生長(zhǎng)曲線 由圖1可見，PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)速度隨著接種細(xì)胞密度的增加而提高。0～8 h各濃度細(xì)胞均處于潛伏期，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL時(shí)，12～36 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，這期間有利于評(píng)價(jià)藥物對(duì)PC12細(xì)胞的促生長(zhǎng)作用。而細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL和5×105個(gè)/mL時(shí)，細(xì)胞增殖過(guò)快，24 h后進(jìn)入平臺(tái)期，對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)造成抑制作用，細(xì)胞密度為5×105和1×105個(gè)/mL時(shí)，細(xì)胞增殖緩慢，24 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。因此，選擇1×105個(gè)/mL的細(xì)胞濃度培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，此時(shí)細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖活性。

圖1 不同接種細(xì)胞密度的生長(zhǎng)曲線

2.2 不同濃度硫酸粘菌素對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響 由表1可見，硫酸粘菌素為62.5 μg/mL時(shí)，在2～12 h表現(xiàn)出一定的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，在12～24 h時(shí)表現(xiàn)出一定的細(xì)胞損傷作用。而125、250、500 μg/mL 的硫酸粘菌素作用的 PC12細(xì)胞存活率均降低，且隨著硫酸粘菌素濃度的增加，細(xì)胞的存活率逐漸下降。隨著硫酸粘菌素作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率也顯著降低。當(dāng)硫酸粘菌素濃度增加到125 μg/mL，作用時(shí)間為24 h時(shí)，硫酸粘菌素開始呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞損傷作用，細(xì)胞活力較正常對(duì)照組差異極顯著（P＜0.001）。因此試驗(yàn)選擇125 μg/mL硫酸粘菌素孵育PC12細(xì)胞24 h建立硫酸粘菌素體外損傷模型。

表1 不同濃度硫酸粘菌素對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響%

3 討論

神經(jīng)細(xì)胞的體外培養(yǎng)是一種應(yīng)用廣泛的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，體外細(xì)胞培養(yǎng)所需樣品量少，研究周期較短，試驗(yàn)條件可嚴(yán)格控制，既可直接觀察細(xì)胞形態(tài)、生物化學(xué)改變以及藥物的保護(hù)作用，又可避免在體試驗(yàn)諸多復(fù)雜因素的影響，所以是生理、藥理、病理等研究領(lǐng)域的重要方法之一（張廣云等，2012）。PC12細(xì)胞為大鼠腎上腺髓質(zhì)瘤細(xì)胞克隆化的細(xì)胞株，具有典型的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特征。PC12細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中性狀穩(wěn)定、均一，具有高度分化潛能，因而成為神經(jīng)科學(xué)離體研究中的重要工具細(xì)胞，廣泛用于神經(jīng)細(xì)胞分化，離子通道、受體和遞質(zhì)釋放的試驗(yàn)材料，也是研究神經(jīng)毒性的最主要的細(xì)胞株之一（王新釗等，2006）。

MTT比色微量分析是一種檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的靈敏方法，重復(fù)性好?；罴?xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶可將外源性的黃色的MTT還原為難溶的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中，而死亡細(xì)胞則無(wú)此功能（陶移文等，2003）。這些藍(lán)紫色的結(jié)晶可被二甲基亞砜溶解，通過(guò)測(cè)定其吸光度值既可反映細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶活性，又能反映細(xì)胞的生長(zhǎng)活性。MTT法與當(dāng)前比較流行的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，如染料排斥法、計(jì)數(shù)法、克隆形成法和同位素?fù)饺敕ㄏ啾?，其?yōu)點(diǎn)是可以在酶標(biāo)儀上快速分析和短期內(nèi)檢測(cè)大量樣品，靈敏度高、準(zhǔn)確性好；與同流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)相比，成本更小，對(duì)活細(xì)胞的檢出率更高（文琛，2007）。

本試驗(yàn)將不同劑量的硫酸粘菌素作用于PC12細(xì)胞不同時(shí)間，以期篩選出最佳造模藥物濃度和造模時(shí)間，試驗(yàn)結(jié)果顯示除62.5 μg/mL的硫酸粘菌素在作用PC12細(xì)胞最初的12 h，表現(xiàn)出了一定的促生長(zhǎng)作用，其他濃度的硫酸粘菌素對(duì)PC12細(xì)胞均有不同程度的損傷作用，細(xì)胞活力和存活率明顯下降，并呈現(xiàn)劑量依賴性，且隨著硫酸粘菌素作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率顯著降低。本試驗(yàn)以125 μg/mL硫酸粘菌素作用PC12細(xì)胞24 h作為體外模型損傷劑量和時(shí)間，更為真實(shí)客觀地反映機(jī)體生理現(xiàn)狀。而且這種細(xì)胞毒性既不像62.5 μg/mL那樣，由于濃度過(guò)低對(duì)PC12細(xì)胞損傷不足，不利于試驗(yàn)觀察；也不像250 μg/mL和500 μg/mL那樣劇烈，造成細(xì)胞的過(guò)度損傷，不利于后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。因此，125 μg/mL作用PC12細(xì)胞24 h是篩選對(duì)抗硫酸粘菌素藥物細(xì)胞模型的最佳藥物濃度和作用時(shí)間。

綜上所述，利用本試驗(yàn)方法建立的細(xì)胞篩選模型具有成本低、效率高、周期短的特點(diǎn)，并且可重復(fù)性好，操作性強(qiáng)，模型穩(wěn)定，故可以用作篩選對(duì)抗硫酸粘菌素神經(jīng)保護(hù)劑的體外模型。

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