張 娟，王遠(yuǎn)興，胡海濤，張 匯，鄧 靜

(食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室南昌大學(xué)，江西南昌 330047)

柱前衍生HPLC-UV-Q-TOF-MS分析黑靈芝多糖的酶解產(chǎn)物

張 娟，王遠(yuǎn)興*，胡海濤，張 匯，鄧 靜

(食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室南昌大學(xué)，江西南昌 330047)

采用1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮(PMP)對(duì)靈芝粗多糖酶解產(chǎn)物進(jìn)行衍生，并利用液相－紫外檢測(cè)器－高分辨四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法(HPLC－UV－Q－TOF－MS)檢測(cè)分析靈芝多糖的單糖組成及其酶解產(chǎn)物。結(jié)果表明，靈芝多糖的單糖組成主要是葡萄糖、甘露糖和半乳糖、及少量的戊糖、巖藻糖和葡萄糖醛酸。經(jīng)HPLC－Q－TOF－MS分析鑒定，β－葡聚糖酶的降解產(chǎn)物為單糖、二糖到五糖的低聚糖，證明靈芝多糖多存在β－糖苷鍵，而果膠復(fù)合酶將黑靈芝多糖主要降解成單糖。

黑靈芝多糖，β－葡聚糖酶，果膠酶，高分辨質(zhì)譜

靈芝是擔(dān)子菌門(mén)擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬藥用真菌，按顏色有赤靈芝、紫靈芝、白靈芝、黃靈芝、黑靈芝、紫靈芝之分［1］，古代就認(rèn)為其有扶正固本、滋補(bǔ)強(qiáng)壯的功效，對(duì)其藥性十分推崇［2］。靈芝多糖可作為腫瘤化學(xué)治療和放射治療的有效輔助治療藥［3］。而黑靈芝具有抗衰老作用，其機(jī)制可能與清除氧自由基和氧活性氧，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶活力有關(guān)［4］。多糖的活性與其相對(duì)分子質(zhì)量大小、單糖組成及分子結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系，且免疫應(yīng)答主要由相對(duì)分子質(zhì)量大小而決定［5］。

靈芝多糖的主要單糖組分為葡萄糖，還有少量的半乳糖、甘露糖、木糖和巖藻糖［6］。與動(dòng)植物多糖不同，真菌多糖分子單體之間，大量地以β－(l，3)和β－(l，6)糖苷鍵結(jié)合，形成鏈狀分子，具有螺旋狀的立體構(gòu)型［7］。靈芝多糖主要由D－葡萄糖單元通過(guò)β－(1，3)糖苷鍵連接的葡聚多糖，并伴有少量的(1，6)位支鏈鍵連接的骨架結(jié)構(gòu)［6，8］。目前靈芝的降解方法［2］很多，但有關(guān)酶法水解靈芝多糖的研究報(bào)道較少。酶具有特異性，可選擇性的切斷糖苷鍵，達(dá)到專一降解作用，制得不同聚合度的產(chǎn)物。研究表明［9］，靈芝多糖在果膠酶作用下產(chǎn)生單糖及低聚糖。根據(jù)靈芝多糖的結(jié)構(gòu)以及本實(shí)驗(yàn)室之前酶篩選工作，本文采用β－葡聚糖酶和果膠酶酶解靈芝多糖，利用HPLC－UV－Q－TOF/MS對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定，旨在建立HPLC－UV－Q－TOF－MS分析酶解產(chǎn)物的方法，為黑靈芝多糖的鑒別及靈芝多糖糖譜［10］建立提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑靈芝 江西省贛州市;葡萄糖(Glucose，Glc)，核糖(Ribose，Rib)，木糖(Xylose，Xyl)，阿拉伯糖(Arabinose，Ara)，半乳糖(Galatose，Gal)，鼠李糖(Rhamnose，Rha)，甘露糖(Mannose，Man)，巖藻糖(Fucse，F(xiàn)uc)，葡萄糖醛酸(Glucuronic acid，Glc－A)等 sigma公司;麥芽糖(Maltose，Malt)，麥芽三糖(Maltotriose，Malto)等標(biāo)準(zhǔn)品 國(guó)藥集團(tuán);β－葡聚糖酶(β－Dextranase) 上海源葉生物科技有限公司;果膠酶(pectinase from Aspergillus Niger)sigma公司; 1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮(PMP) 阿拉丁公司;三氟乙酸 國(guó)藥集團(tuán);實(shí)驗(yàn)用水均為 Millipore超純水。

SHZ－Ⅱ循環(huán)水式多用真空泵 上海亞榮生化儀器廠;DSY－Ⅵ氮吹儀 北京東方精華苑科技有限公司;TGL－16C離心機(jī) 上海安亭科儀器廠;Agilent 6538高分辨四級(jí)桿－飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Q－TOF－MS)

美國(guó)安捷倫;Agilent 1290超高效液相色譜儀，包括1290泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，1290光電二級(jí)管陣列檢測(cè)器，柱溫箱 美國(guó)安捷倫。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:ZORBAX SB－C18柱(4.6mm×250mm，5μm);柱溫:30℃;流量:1mL/min，進(jìn)入質(zhì)譜的流量由三通閥調(diào)為0.3mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)245nm;進(jìn)樣量:10μL;記錄時(shí)間:42min。流動(dòng)相［11］: A，10%(V/V)乙腈+0.10mol/L醋酸銨溶液;溶劑B，25%(V/V)乙腈+0.10mol/L醋酸銨溶液。洗脫梯度:0～40min，45%～100%B，40～42min，100%～45%B。

1.2.2 質(zhì)譜分析條件 離子源:ESI源;檢測(cè)模式:負(fù)離子檢測(cè);干燥氣溫度:350℃;干燥氣流速:10L/min;霧化氣壓力:40psi;毛細(xì)管裂解電壓:120V;掃描范圍:m/z 50～3200。

1.3 樣品的制備

1.3.1 靈芝多糖的提取 粉碎干燥的黑靈芝，用95%乙醇室溫浸泡12h脫脂，加入蒸餾水，90℃下提取3h，過(guò)濾，濃縮。濾液加入無(wú)水乙醇在4℃下沉淀多糖(多糖水溶液∶乙醇=4∶1)，離心，沉淀物冷凍干燥后備用，即得黑靈芝粗多糖。

1.3.2 酸解和酶解 酸解:精密稱取靈芝粗多糖10mg，加入2mol/L的三氟乙酸溶液2mL，混勻，封口，放入烘箱105℃充分水解6h。取出，冷卻至室溫，水解產(chǎn)物按1.3.3衍生條件衍生即得衍生產(chǎn)物。

酶解:精密稱取靈芝粗多糖5mg兩份，分別溶于緩沖液醋酸鈉－醋酸(pH為3.6和5.4)于1.5mL的EP管中，配制成質(zhì)量濃度為5mg/mL的多糖溶液。果膠酶和β－葡聚糖酶分別加入多糖溶液中，分別配制成最終濃度6.9U/mL和2500U/mL。50℃水浴過(guò)夜酶解(時(shí)間≥15h)，于85℃水浴30min終止。15000r/min離心30min，取上清液，70℃下氮?dú)獯蹈桑謩e用于衍生反應(yīng)，多糖溶液做空白對(duì)照。

1.3.3 PMP衍生 參考文獻(xiàn)［11］，對(duì)單糖和多糖衍生化反應(yīng)，并對(duì)衍生反應(yīng)條件進(jìn)行改進(jìn)，用氨水替代NaOH，避免在處理過(guò)程中產(chǎn)生鹽對(duì)質(zhì)譜信號(hào)產(chǎn)生干擾。將酸解和酶解產(chǎn)物與氨水溶液混合，加入200μL 0.5mol/L的PMP甲醇溶液，于70℃水浴鍋中反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢，在70℃下氮?dú)獯蹈沙H3，殘留物用1mL水溶解，加1mL氯仿劇烈震蕩除水相中PMP，再于8000r/min條件下離心5min，取上層水相，重復(fù)萃取三次，最后水相用0.22μm的針頭式過(guò)濾器過(guò)濾，濾液進(jìn)行HPLC－UV－Q－TOF/MS分析?；鞓?biāo)包含8種單糖標(biāo)品(核糖，鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，巖藻糖，濃度均為1mg/mL)、葡萄糖醛酸(濃度均為1mg/mL)，麥芽糖和麥芽三糖(濃度為1mg/mL)，并按上述衍生步驟進(jìn)行操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝多糖的單糖組成分析

采用HPLC－UV對(duì)靈芝多糖的單糖組成進(jìn)行分離。從圖1中可以看出，靈芝樣品中單糖組成主要是甘露糖、葡萄糖、半乳糖，還有少量的核糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸，結(jié)果與文獻(xiàn)［12－13］基本一致。

圖1 糖的PMP衍生物液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of derivatization with PMP of saccharides

2.2 靈芝多糖酶解產(chǎn)物分析

黑靈芝多糖的骨架和支鏈由甘露糖、葡萄糖、半乳糖及少量的核糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸通過(guò)β－(1，3)，β－(1，4)，β－(1，6)糖苷鍵結(jié)合而成，主鏈?zhǔn)怯蒁－葡萄糖單元通過(guò)β－(1，3)糖苷鍵連接的葡聚糖。另外，多糖通過(guò)化學(xué)或酶降解的方式獲得降解產(chǎn)物片段，這些片段有利于多糖的鑒定。根據(jù)黑靈芝多糖結(jié)構(gòu)和相關(guān)研究［9］，真菌發(fā)酵制成的β－葡聚糖酶，包括4種酶［14］(內(nèi)－β－(1，3)－葡聚糖酶、內(nèi)－β－(1，3)－(1，4)－葡聚糖酶、外－β－(1，3)－葡聚糖酶、外β－(1，4)－葡聚糖酶)，能夠作用于非淀粉多糖β－葡聚糖的β－(1，3)，β－(1，4)糖苷鍵［15］，使葡聚糖降解為寡糖。所以該實(shí)驗(yàn)用酶可將以β－(1，3)糖苷鍵為主的黑靈芝多糖降解為寡糖。果膠酶中含有聚半乳糖醛酸酶、聚鼠李半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木糖基半乳糖醛酸酶［16］，可將其支鏈降解。如表1，靈芝多糖經(jīng)酶解產(chǎn)生少量的單糖及寡糖片段，因此，需進(jìn)一步深入研究多糖酶解，獲得更多細(xì)節(jié)信息。

一般來(lái)說(shuō)，直接采用UV和MS檢測(cè)糖類很難達(dá)到理想效果，因?yàn)槠湓谧贤鈪^(qū)沒(méi)有吸收，不易離子化。為了提高靈敏度和可檢測(cè)性，本實(shí)驗(yàn)采用柱前衍生檢測(cè)多糖酶解產(chǎn)物。8種單糖、葡萄糖醛酸、麥芽糖和麥芽三糖作為衍生對(duì)照，在245nm波長(zhǎng)處有吸收并且可以被質(zhì)譜檢測(cè)，且只出現(xiàn)［M－H］－的分子離子峰，不出現(xiàn)與其他離子的加合離子峰(圖2，圖3)。本文采用負(fù)離子模式掃描，戊糖(核糖，木糖，阿拉伯糖)，己糖(甘露糖，葡萄糖，半乳糖)在質(zhì)譜上對(duì)應(yīng)的峰分別是 m/z 479.1834(［M－H］－)，m/z 509.1940，鼠李糖和巖藻糖的質(zhì)譜特征峰是 m/z 493.1610，葡糖糖醛酸，麥芽糖和麥芽三糖的質(zhì)譜特征峰分別是 m/z 523.1746，m/z 671.2480，m/z 833.2976。質(zhì)譜峰根據(jù)精確分子質(zhì)量可初步判斷(如表1，圖3所示)。

表1 黑靈芝單糖及寡糖的ESI－MS解析Table 1 ESI－MS results of the Ganoderma atrum oligosaccharides

為了確保檢測(cè)到的糖類是來(lái)自多糖酶解的產(chǎn)物，采用多糖空白作為對(duì)照。結(jié)果表明，多糖的峰不影響其酶解產(chǎn)物的分析(如圖2所示)。對(duì)比兩種酶解產(chǎn)物的紫外圖譜，發(fā)現(xiàn)黑靈芝多糖的β－葡聚糖酶酶解產(chǎn)物所得的峰較多，有些峰在TIC圖上未達(dá)到基線分離，出峰時(shí)間主要集中在30～40min。但從質(zhì)譜圖(圖3中c～f)中可找到對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰。β－葡聚糖酶酶解產(chǎn)物主要是單糖和寡糖，寡糖有二糖，三糖，四糖和五糖(如圖2、圖3所示)。果膠酶酶解產(chǎn)物主要是單糖，其中葡萄糖，甘露糖，半乳糖和葡萄糖醛酸含量較高。

3 討論

紫外光譜圖在液相色譜上應(yīng)用極為廣泛，靈敏度高，但是由于缺乏特定寡糖的標(biāo)準(zhǔn)品，使其應(yīng)用具有一定的局限性。高分辨質(zhì)譜是目前檢測(cè)的一種重要的方法［17］，具有樣品用量少、精確度高、靈敏度高的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于糖分析［18－19］。經(jīng)檢測(cè)靈芝多糖衍生物的單糖組成主要有葡萄糖，甘露糖，半乳糖。從寡糖的單糖組成初步可知，單糖之間的鏈接既有同一單糖的鏈接，也有不同單糖間的鏈接，導(dǎo)致了靈芝多糖的復(fù)雜性。

采用超高效液相－紫外－飛行質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析酶解解產(chǎn)物時(shí)，確定水解產(chǎn)物中有靈芝多糖在β－葡聚糖酶的作用下產(chǎn)生了己糖、戊糖、二糖至低聚五糖等低分子量片段，進(jìn)一步證明靈芝多糖多存在β－糖苷鍵;果膠酶酶解產(chǎn)物中主要是單糖。因此，兩種酶對(duì)黑靈芝都有一定的降解作用。而本實(shí)驗(yàn)酶解只得到黑靈芝多糖的部分結(jié)構(gòu)信息，因此要進(jìn)一步研究酶解，獲得黑靈芝多糖酶解產(chǎn)物中的大分子片段以及具體糖苷鍵的斷裂位點(diǎn)信息。

圖2 β－葡聚糖酶和果膠酶酶解產(chǎn)物的TIC圖和對(duì)應(yīng)的DAD圖Fig.2 The TIC spectras and the corresponding DAD chromatograms of β－dextranase and pectinase hydrolysis products

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The analysis of enzymatic products of Ganoderma atrum polysaccharides by pre－column derivatization HPLC－UV－Q－TOF/MS

ZHANG Juan，WANG Yuan－xing*，HU Hai－tao，ZHANG Hui，DENG Jing
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China)

1－phenyl－3－methyl－5－pyrazolone(PMP)was applied to derivate polysaccharide degradation product.Then liquid chromatography with ultraviolet detector－h(huán)igh resolution quadrupole tandem time of flight mass spectrometry(HPLC－UV－Q－TOF－MS)was used to detect and analyze monosaccharide compositions and enzymatic hydrolysate ofGanoderma atrumpolysaccharide.The results showed that the monosaccharide compositions ofGanoderma atrumpolysaccharides were mainly glucose，mannose，galactose.The degradation products of β－glucanase were monosaccharides and oligosaccharides from disaccharide to pentasaccharides，butGanoderma atrumpolysaccharides were mainly degraded into monosaccharides by pectic enzyme.

Ganoderma atrumpolysaccharide;β－dextranase;pectinase;high resolution mass spectrometry

TS207.3

A

1002－0306(2014)05－0285－04

2013－07－12 *通訊聯(lián)系人

張娟(1989－)，女，碩士研究生，主要研究方向:營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31160321)。