司賀龍+郭云霞+孫志穎+郝慶紅+劉月琴

摘要：為了篩選對雛雞腹瀉具有顯著預(yù)防作用的芽孢益生菌，采用瓊脂平板擴散法，以大腸桿菌菌株為病源指示菌，從健康雞腸道中篩選到1株具有較強抑菌活性的拮抗細(xì)菌JM-42菌株，對該菌株進行形態(tài)學(xué)、生理生化、16S rDNA 序列分析，同時采用有機溶劑萃取和鹽析法對其代謝產(chǎn)物進行提取，對其產(chǎn)物物質(zhì)種類及性質(zhì)進行分析。結(jié)果表明，JM-42菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株Bacillus velezensis的同源性最高，為99.92%，且二者在所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上的同一分支上，最終鑒定JM-42菌株為B. velezensis。通過對其代謝產(chǎn)物進行初步分析得出，其拮抗物質(zhì)為蛋白質(zhì)，50%硫酸銨鹽析所得到的蛋白質(zhì)組分活性最強，且對熱及酸堿敏感性較弱，性質(zhì)比較穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：雞；芽孢益生菌；篩選；鑒定；抗菌蛋白

中圖分類號：S852.6 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0208-04

益生菌是指通過攝取適當(dāng)?shù)牧?，能夠起到有效作用的活菌，它是通過調(diào)節(jié)腸道微生物生態(tài)平衡，改善腸道防御功能、維護腸道屏障功能的微生態(tài)制劑^[1-2]。目前，歐盟等國家均出臺了相應(yīng)政策、法律來嚴(yán)格限制甚至禁止抗生素的使用，作為抗生素功能的替代品，微生態(tài)制劑以其無污染、無殘留、促生長并具有提高免疫力、促消化的功能而受到人們的關(guān)注。芽孢桿菌可以形成芽孢的兼性厭氧菌，具有很強的抗逆性，而且還可以產(chǎn)生多種消化酶及維生素等營養(yǎng)物質(zhì)^[3]，且芽孢細(xì)菌后期的規(guī)?；a(chǎn)可操作性強，易于推廣應(yīng)用，因此成為目前微生態(tài)制劑的首選菌種。幼齡動物由于生長發(fā)育不完全，易受到環(huán)境、飼料、疾病的影響，導(dǎo)致一些消化道疾病，為了保證益生菌進入機體內(nèi)的活性及定植，本試驗從健康雞腸道中篩選對致病性大腸桿菌有顯著拮抗作用的芽孢菌株，并對其抑菌物質(zhì)進行初步分析，為雞源芽孢益生菌的后期研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

致病性大腸桿菌，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程系實驗室保存。

1.2 樣品采集

新鮮的健康雞腸道，取自河北省清苑縣某肉雞養(yǎng)殖場。

1.3 培養(yǎng)基

細(xì)菌用培養(yǎng)基包括NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基^[4]；

生理生化鑒定用培養(yǎng)基依據(jù)鑒定手冊中的方法^[5]進行配制。

1.4 試驗方法

1.4.1 雞源芽孢桿菌的分離

從健康雞新鮮盲腸中取1 g內(nèi)容物，溶于10 mL無菌水中，80 ℃水浴滅菌20 min。用無菌水10倍梯度稀釋，取適當(dāng)稀釋梯度的懸液在平板上涂布，每個稀釋度涂布3個平板，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，獲得單菌落。挑取不同形態(tài)單菌落轉(zhuǎn)接到NA培養(yǎng)基斜面上純培養(yǎng)，每個平板劃4個菌，編號，記錄。

1.4.2 雞源芽孢桿菌的初篩和復(fù)篩

將不同菌落分別轉(zhuǎn)接到含大腸桿菌的病原菌平板上，與大腸桿菌對峙生長，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。觀察是否有抑菌圈出現(xiàn)，進而挑選出形成抑菌圈的菌株，置于-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

從初篩的拮抗細(xì)菌中選出抑菌活性較高的菌進行復(fù)篩。將挑選出來的菌株，以NA培養(yǎng)基活化后，接種于NB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，取用0.2 μm微孔濾膜過濾除菌的拮抗細(xì)菌發(fā)酵液約15 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h，測量并記錄抑菌圈直徑。

1.4.3 雞源芽孢桿菌JM-42菌株的種屬鑒定

根據(jù)菌株的菌落形態(tài)特征、菌體形態(tài)特征、革蘭氏染色性狀、芽孢染色性狀、有關(guān)生理生化鑒別試驗，參照文獻[5]與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》進行屬和種的鑒定。

1.4.4 雞源芽孢桿菌JM-42菌株的生理生化鑒定

按照相應(yīng)屬、種鑒定的有關(guān)內(nèi)容進行生理生化鑒定。試驗要求分別進行接觸酶試驗、H2S產(chǎn)生試驗、吲哚試驗、明膠液化試驗、氨基酸脫羧酶試驗、淀粉水解、V-P試驗、M.R試驗、檸檬酸鹽利用和糖、醇發(fā)酵等。

1.4.5 雞源芽孢桿菌JM-42菌株的16S rDNA的鑒定

1.4.5.1 雞源芽孢桿菌JM-42菌株基因組DNA的提取及其PCR擴增和序列測定

取對數(shù)生長期菌株的發(fā)酵液（培養(yǎng)4～12 h）750 μL至EP管中，4 ℃下10 000 r/min離心 10 min，重復(fù)3次。用無菌水振蕩洗沉淀2次（洗殘留的發(fā)酵液），4 ℃下10 000 r/min離心10 min。加400 μL TE（Tris-HCl和EDTA混合液）溶解沉淀。液面下加入20 μL溶菌酶（50 mg/mL），輕輕搖勻混合，置于37 ℃溫育過夜，間歇搖動EP管，加400 μL CTAB，65 ℃水浴40 min。冷卻至室溫，加入400 μL酚-三氯甲烷（1 ∶1），輕輕混勻，4 ℃下12 000 r/min離心10 min。移取上清，加入350 μL三氯甲烷，輕輕混勻，4 ℃ 下12 000 r/min 離心10 min。取上清，加入等體積冰凍異丙醇，輕輕搖勻，置于-20 ℃冰箱 1～4 h，沉淀DNA。取出后，12 000 r/min 離心10 min。沉淀以75%乙醇洗2次，風(fēng)干（至完全去除乙醇?xì)馕叮?，得到DNA粗品。

純化DNA：加入200 μL TE溶解沉淀，液面下加入RNA酶（20 mg/mL），37 ℃保溫30 min。加入400 μL 酚-三氯甲烷（1 ∶1），輕輕混勻，4 ℃下12 000 r/min離心10 min。移取上清，加入350 μL三氯甲烷，輕輕混勻，4 ℃下12 000 r/min離心10 min。取上清，加入1/10體積的2 mol/L KAc溶液和2倍體積的無水乙醇，置于-20 ℃保藏1～12 h。取出，4 ℃下 10 000 r/min 離心10 min。用75%乙醇洗2次，風(fēng)干。加 20～30 μL TE溶解沉淀，于-20 ℃保藏。endprint

凡是離心后吸取上清液的步驟，必須使用處理過的槍頭。剪去槍尖2 mm左右，目的是減少對DNA片段的剪切力，提高收率。

JM-42的基因組DNA擴增引物為細(xì)菌的16S rDNA通用引物，正向引物PrimerA：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物PrimerB：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR擴增的條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸90 s，共32個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后，送往上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.4.5.2 雞源芽孢桿菌JM-42菌株16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹繪制

利用BLAST方式將測定好的JM-42菌株的16S rDNA序列與GenBank中所有已測定的芽孢桿菌屬16S rDNA基因序列進行同源序列分析比對，選取序列相似性高的菌株用ClustaX 1.8軟件對比序列的相似性，并利用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.6 雞源芽孢桿菌JM-42菌株的產(chǎn)物性質(zhì)分析

1.4.6.1 溶劑萃取

將JM-42菌株活化后用NB培養(yǎng)基進行靜置液體發(fā)酵。取48 h發(fā)酵液4份，每份100 mL，離心后分別用1/3體積的三氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液在通風(fēng)處內(nèi)自然揮發(fā)至干燥，分別用5.0 mL蒸餾水溶解后，用瓊脂打孔擴散法在病原菌平板上測定抗菌活性，在同一平板上同時測定發(fā)酵液、萃余液的抗菌活性，并以蒸餾水作為陰性對照、發(fā)酵液作陽性對照。

1.4.6.2 硫酸銨鹽析

取48 h發(fā)酵液200 mL，離心后在不斷攪拌情況下緩慢添加硫酸銨30%、60%、80%飽和度，于 4 ℃ 冰箱沉淀過夜，10 000 r/min離心10 min得沉淀，加 0.01 mol/L Tris-HCl（pH值7.4）緩沖液溶解，透析，凍干。用0.01 mol/L Tris-HCl（pH值7.4），經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，制成10 mg/mL抗菌物溶液，用于拮抗活性測定。用瓊脂打孔擴散法在病原菌平板上測定透析液抗菌活性，在同一平板上同時作蒸餾水陰性對照和發(fā)酵液陽性對照。

1.4.6.3 粗蛋白穩(wěn)定性研究

將粗提拮抗蛋白用無菌水配成濃度為10 mg/mL的溶液。分別測定粗蛋白對熱、pH值的穩(wěn)定性和對胰蛋白酶的敏感性，從而初步判斷抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性。

粗蛋白熱穩(wěn)定性的測定：將拮抗蛋白的粗提取液分別在40、60、80、100 ℃以及0.1 MPa、121 ℃各處理20 min，然后進行抑菌活性的測定。以常溫處理的蛋白液作對照，25 ℃培養(yǎng)2 d后觀察抑菌結(jié)果，并測量抑菌圈直徑，比較分析結(jié)果。

粗蛋白pH值穩(wěn)定性的測定：將拮抗蛋白的粗提液與磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液等體積混合，再用0.01 mol/L鹽酸或氫氧化鈉分別調(diào)pH值至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0進行抑菌活性的測定，25 ℃培養(yǎng)2 d后觀察抑菌結(jié)果，以瓊脂打孔擴散法，觀察不同pH值發(fā)酵液的抑菌效果，比較分析結(jié)果。

粗蛋白對胰蛋白酶的敏感性：將抗菌粗蛋白提取液分裝于Ep管中，1 ∶1加入2 mg/mL胰蛋白酶溶液，以加無菌水的發(fā)酵上清液作對照，用瓊脂打孔擴散法，在病原菌平板上選擇合適的間距打孔，作3個平行，在37 ℃恒溫孵育0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，觀察經(jīng)胰蛋白酶處理不同時間的抗菌粗蛋白的抑菌效果，測量抑菌圈直徑作記錄。以上各處理和對照分別用抑菌圈法測定其抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的初篩

將分離得到的不同特征的耐高溫單菌落經(jīng)純化后分別與大腸桿菌進行對峙生長試驗，從初篩的70株拮抗細(xì)菌中選出抑菌活性較高的20株菌進行復(fù)篩。

2.2 拮抗細(xì)菌的復(fù)篩

對20株形態(tài)不同的活性較高的菌株進行復(fù)篩，共分離得到具有較高拮抗作用的菌株5株，其抑菌圈直徑均不小于 11 mm（表1），其中菌株JM-42抑菌圈直徑為14.2 mm，能有效抑制大腸桿菌的生長。

3 結(jié)論與討論

芽孢益生菌作為微生態(tài)制劑的一種重要來源細(xì)菌，在維護動物腸道健康、促進微生態(tài)平衡等方面發(fā)揮著重要的作用。芽孢細(xì)菌在逆境環(huán)境下形成芽孢，在溫度、pH值、營養(yǎng)條件適粗時萌發(fā)生長，產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)揮其益生作用。但芽孢桿菌在常規(guī)動物腸道發(fā)揮生理功能，可能是通過與其他微生物相互作用的結(jié)果，而非單一的芽孢桿菌在倡導(dǎo)生長代謝造成的^[7]。通過拮抗作用來篩選益生菌，是最直接有效的途徑^[8]。本試驗從雞腸道中篩選出對致病性大腸桿菌具有顯著拮抗作用的菌株，經(jīng)復(fù)篩可以確定，JM-42菌株的代謝產(chǎn)物中含有較高的抑菌活性物質(zhì)，能產(chǎn)生有效的抑菌作用，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化、16S rDNA序列分析得出雞源JM-42菌株為Bacillus velezensis。

細(xì)菌素是某些細(xì)菌產(chǎn)生的具有抗菌活性的多肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物^[9]，目前由益生菌中的乳酸菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素有40余種^[10]。益生菌中的乳酸菌在代謝過程中除細(xì)菌素外，還能產(chǎn)生乙酸、乳酸及過氧化氫等具有抑菌活性的物質(zhì)。因此，為了排除這些非細(xì)菌素物質(zhì)的干擾，本研究利用硫酸銨鹽析對代謝產(chǎn)物進行粗蛋白的分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50%硫酸銨對粗蛋白提取量最大，抑菌效果最明顯。因此，證明了JM-42菌株發(fā)酵液中提取物的抗菌活性是類細(xì)菌素所致，而不是有機酸和過氧化氫所致。

JM-42抗菌蛋白在較廣泛的pH范圍內(nèi)都有較好的抑菌活性，酸堿適應(yīng)性較強；在外界溫度為40 ℃時抑菌活性最強，但在40～100 ℃ 下抑菌活性稍有減弱，在121 ℃下明顯有所減弱，但在此溫度下仍有抑菌圈出現(xiàn)，說明JM-42抗菌蛋白粗提液具有較好的熱穩(wěn)定性。20世紀(jì)80年代初，Hultmark等研究在滯育德惜比古天蠶蛹中利用大腸桿菌誘導(dǎo)時發(fā)現(xiàn)一類新型的抗菌蛋白，該蛋白分子量在7 ku，不同于溶菌酶的15 ku，與氨基酸組成相似，具有熱穩(wěn)定性^[11]，與申吉泓等報道^[12]一致。在用胰蛋白酶處理孵育的過程中仍出現(xiàn)抑菌圈，說明該抗菌粗蛋白對胰蛋白酶不敏感。JM-42作為飼料添加劑應(yīng)用于飼料中，在動物消化道產(chǎn)生的抗菌蛋白不會被胰蛋白酶降解，能發(fā)揮其抗菌作用?？咕某煞譃橐紫盏陌被?，可作為畜禽飼料添加劑取代或部分取代目前飼喂動物所用的抗生素，減少抗生素對動物體的危害。目前，利用酵母產(chǎn)生抗菌肽酵母制劑，在預(yù)防及治療仔豬白痢、雛雞白痢方面有明顯效果?？傊?，該蛋白質(zhì)性質(zhì)較穩(wěn)定，耐熱耐酸能力強，對病原細(xì)菌有較強的抑制能力，由蛋白類物質(zhì)或非單一抗菌物質(zhì)所組成，有關(guān)其組分和結(jié)構(gòu)鑒定方面須要進一步研究。本研究結(jié)果為益生菌的進一步應(yīng)用提供技術(shù)支持。endprint

參考文獻：

[1]Shah N P. Functional cultures and health benefits[J]. International Dairy Journal，2007，17（11）：1262-1277.

[2]Reid G，Jass J，Sebulsky M T，et al. Potential uses of probiotics in clinical practice[J]. Clinical Microbiology Reviews，2003，16（4）：658-672.

[3]郭小華，趙志丹，熊海容. 益生芽胞桿菌腸道微生態(tài)學(xué)研究進展[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志，2010，22（12）：1136-1139.

[4]錢存柔，黃儀秀. 微生物學(xué)實驗教程[M]. 北京：北京大學(xué)出版社，1999：54.

[5]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[6]王 偉，李術(shù)娜，姜軍坡，等. 大麗輪枝菌拮抗細(xì)菌7-63菌株的鑒定與抗菌物性質(zhì)分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（6）：1389-1392.

[7]Cardona M E，Norin E，Midtvedt T. Biochemical functions of Bacillus licheniformis in gnotobiotic mice[J]. Microbial Ecology in Health and Disease，2003，15（1）：40-42.

[8]張紅英，楊 霞，金 鉞，等. 雞腸源芽孢桿菌的分離、鑒定和抗菌活性[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志，2007，19（6）：504-506.

[9]袁 靜，李元端，劉變芳，等. 乳酸菌的細(xì)菌素及乳鏈菌肽在食品工業(yè)中的發(fā)酵與應(yīng)用[J]. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2002，18（5）：544-549，533.

[10]張艾青，劉書亮，敖 靈. 產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的篩選和鑒定[J]. 微生物學(xué)通報，2007，34（4）：753-756.

[11]Hultmark D，Steiner H，Rasmuson T，et al. Insect immunity purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia[J]. European Journal of Biochemistry，1980，106（1）：7-16.

[12]申吉泓，楊宇如，唐孝達. 抗菌肽作用機制研究現(xiàn)狀[J]. 國外醫(yī)學(xué)：腫瘤學(xué)分冊，2003，30（5）：347-350.endprint

參考文獻：

[1]Shah N P. Functional cultures and health benefits[J]. International Dairy Journal，2007，17（11）：1262-1277.

[2]Reid G，Jass J，Sebulsky M T，et al. Potential uses of probiotics in clinical practice[J]. Clinical Microbiology Reviews，2003，16（4）：658-672.

[3]郭小華，趙志丹，熊海容. 益生芽胞桿菌腸道微生態(tài)學(xué)研究進展[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志，2010，22（12）：1136-1139.

[4]錢存柔，黃儀秀. 微生物學(xué)實驗教程[M]. 北京：北京大學(xué)出版社，1999：54.

[5]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[6]王 偉，李術(shù)娜，姜軍坡，等. 大麗輪枝菌拮抗細(xì)菌7-63菌株的鑒定與抗菌物性質(zhì)分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（6）：1389-1392.

[7]Cardona M E，Norin E，Midtvedt T. Biochemical functions of Bacillus licheniformis in gnotobiotic mice[J]. Microbial Ecology in Health and Disease，2003，15（1）：40-42.

[8]張紅英，楊 霞，金 鉞，等. 雞腸源芽孢桿菌的分離、鑒定和抗菌活性[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志，2007，19（6）：504-506.

[9]袁 靜，李元端，劉變芳，等. 乳酸菌的細(xì)菌素及乳鏈菌肽在食品工業(yè)中的發(fā)酵與應(yīng)用[J]. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2002，18（5）：544-549，533.

[10]張艾青，劉書亮，敖 靈. 產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的篩選和鑒定[J]. 微生物學(xué)通報，2007，34（4）：753-756.

[11]Hultmark D，Steiner H，Rasmuson T，et al. Insect immunity purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia[J]. European Journal of Biochemistry，1980，106（1）：7-16.

[12]申吉泓，楊宇如，唐孝達. 抗菌肽作用機制研究現(xiàn)狀[J]. 國外醫(yī)學(xué)：腫瘤學(xué)分冊，2003，30（5）：347-350.endprint

參考文獻：

[1]Shah N P. Functional cultures and health benefits[J]. International Dairy Journal，2007，17（11）：1262-1277.

[2]Reid G，Jass J，Sebulsky M T，et al. Potential uses of probiotics in clinical practice[J]. Clinical Microbiology Reviews，2003，16（4）：658-672.

[3]郭小華，趙志丹，熊海容. 益生芽胞桿菌腸道微生態(tài)學(xué)研究進展[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志，2010，22（12）：1136-1139.

[4]錢存柔，黃儀秀. 微生物學(xué)實驗教程[M]. 北京：北京大學(xué)出版社，1999：54.

[5]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[6]王 偉，李術(shù)娜，姜軍坡，等. 大麗輪枝菌拮抗細(xì)菌7-63菌株的鑒定與抗菌物性質(zhì)分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（6）：1389-1392.

[7]Cardona M E，Norin E，Midtvedt T. Biochemical functions of Bacillus licheniformis in gnotobiotic mice[J]. Microbial Ecology in Health and Disease，2003，15（1）：40-42.

[8]張紅英，楊 霞，金 鉞，等. 雞腸源芽孢桿菌的分離、鑒定和抗菌活性[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志，2007，19（6）：504-506.

[9]袁 靜，李元端，劉變芳，等. 乳酸菌的細(xì)菌素及乳鏈菌肽在食品工業(yè)中的發(fā)酵與應(yīng)用[J]. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2002，18（5）：544-549，533.

[10]張艾青，劉書亮，敖 靈. 產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的篩選和鑒定[J]. 微生物學(xué)通報，2007，34（4）：753-756.

[11]Hultmark D，Steiner H，Rasmuson T，et al. Insect immunity purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia[J]. European Journal of Biochemistry，1980，106（1）：7-16.

[12]申吉泓，楊宇如，唐孝達. 抗菌肽作用機制研究現(xiàn)狀[J]. 國外醫(yī)學(xué)：腫瘤學(xué)分冊，2003，30（5）：347-350.endprint