寧志怨+董玲+李衛(wèi)文+廖華俊+江芹

摘要：栝樓是常用的大宗藥用植物，其性別分化一直是研究的重點(diǎn)。本文對(duì)栝樓雌、雄性別分化的組織形態(tài)鑒別、生理生化鑒別、性別相關(guān)基因的分子標(biāo)記鑒別等進(jìn)行綜述，并對(duì)今后栝樓性別研究的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望，最后提出了相關(guān)建議。

關(guān)鍵詞：栝樓；雌雄異株；性別分化；性別鑒定

中圖分類號(hào)：S567.23+9.03 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0004-03

栝樓（Trichosanthes kirilowii L.），又稱瓜蔞、吊瓜、野葫蘆等，屬葫蘆科栝樓屬多年生草本植物，是我國(guó)常用的中藥材，主要分布在東亞以及澳大利亞的北部地區(qū)，國(guó)內(nèi)種植地區(qū)主要包栝河北、山東、長(zhǎng)江流域以及華南和西南等地區(qū)。栝樓的果實(shí)、果皮、仁、根皆可入藥，有解熱止渴、利尿、鎮(zhèn)咳祛痰等作用，栝樓制劑對(duì)冠心病心絞痛有一定療效。栝樓的根又名天花粉，含有淀粉、皂苷、天花粉蛋白、多種氨基酸以及多糖類等物質(zhì)。近些年研究發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白具有抗腫瘤及抗艾滋病的活性，天花粉多糖具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，能增強(qiáng)免疫活性，具有顯著的抗腫瘤和細(xì)胞毒活性。栝樓的種子營(yíng)養(yǎng)豐富，富含不飽和脂肪酸、氨基酸以及多糖類等物質(zhì)。近年來(lái)栝樓種植面積迅速擴(kuò)大，產(chǎn)業(yè)前景潛力巨大。

栝樓是雌雄異株，隨著栝樓種子被開發(fā)為休閑保健食用栝樓籽、栝樓油等，生產(chǎn)上栝樓種植主要以雌株為主，雄株主要作為授粉植株；而另一方面以收獲地下塊根（天花粉）為目標(biāo)的主要以種植雄株為主。用栝樓種子繁育的后代，雄株的比例一般均超過(guò)90%，因此研究栝樓種子后代性別分化的機(jī)理以及性別的苗期鑒定對(duì)于栝樓的育種研究具有非常重要的作用。除此之外，植物性別一直是植物生殖生物學(xué)和植物遺傳學(xué)研究所關(guān)注的核心。性別分化的模式植物黃瓜的性別分化研究目前已經(jīng)取得了突破性的進(jìn)展。最新的研究結(jié)果表明乙烯代謝途徑的相關(guān)基因?qū)Υ菩弁甑狞S瓜的性別分化起著非常重要的作用。而雌雄異株植物栝樓的性別分化的機(jī)理還未見相關(guān)報(bào)道。因此研究栝樓性別分化的機(jī)理以及性別的鑒定對(duì)于研究雌雄異株植物的性別分化的機(jī)理具有非常重要的作用。植物性別是一種自然現(xiàn)象，既有遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，也容易受生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中各種環(huán)境因素的影響，存在著與動(dòng)物性別不同的遺傳規(guī)律和調(diào)節(jié)方式。因此，研究植物性別現(xiàn)象及其遺傳機(jī)制對(duì)于尋求早期鑒定性別的方法以達(dá)到人為控制植物性別分化的目的，這在植物學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。

1 栝樓的性別表現(xiàn)類型與特點(diǎn)

栝樓屬植物一般認(rèn)為是嚴(yán)格的雌雄異株植物，但是我們?cè)谘芯窟^(guò)程中觀察到偶有少數(shù)植株是雌雄同株，存在著性別的多樣性。栝樓雌株的雌花與雄株的雄花都屬于生理上的單性花。研究結(jié)果表明在雌雄異株植物中，單性別主要由遺傳決定，但是單性性別的表達(dá)可能受到激素和環(huán)境因子等影響^[1-2]。

2 栝樓性別分化與鑒定

2.1 組織形態(tài)學(xué)

在雌、雄栝樓染色體的研究方面：Karmakar等在對(duì)栝樓二倍體雌、雄株染色體進(jìn)行觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，二倍體雌、雄株染色體之間不存在XY型染色體的分化，認(rèn)為栝樓的性別表達(dá)可能主要是由遺傳控制的^[3]。

在雌、雄栝樓花器官的形態(tài)學(xué)研究方面：花期雄花單生、總狀花序或兩者并生，雌花則為單生，據(jù)此可較為明確地區(qū)分栝樓的雌、雄株。雄株出現(xiàn)花蕾的同時(shí)花梗伸長(zhǎng)，繼而開花；而雌株最先是花梗伸長(zhǎng)，子房開始膨大，然后出現(xiàn)花蕾繼而開花，即雌株果實(shí)從分化初始就出現(xiàn)子房膨大。因此雌、雄花蕾未出現(xiàn)前即可通過(guò)花梗伸長(zhǎng)后是否出現(xiàn)子房膨大判定雌、雄株。根據(jù)這種方法并結(jié)合花期和果期來(lái)判定性別進(jìn)行驗(yàn)證，準(zhǔn)確率達(dá)100%。除此之外，花蕾開放以后，雄花的五朵花瓣完全展開，雌花花瓣仍皺縮在一起；雄花中可見明顯的黃色花藥，不見柱頭，雌花中可見明顯的三裂柱頭。通過(guò)以上幾種特征，均可以可靠區(qū)分雄株和雌株。曲超等在對(duì)栝樓種子的質(zhì)量與栝樓性別的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，隨著種子質(zhì)量的增加，由該種子長(zhǎng)出的植株的雄株比例逐漸減少，雌株比例逐漸增加，雌株比例與種子大小存在顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.948 8，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)18%的雌花中出現(xiàn)花藥的情況，但電鏡掃描的結(jié)果卻表明花藥中并不存在花粉^[4]。另一方面我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)少量雄株中存在雌蕊發(fā)育的情況。

2.2 生理、生化

植物激素、多胺、可溶性糖的含量以及一些酶的活性等都與性別分化關(guān)系密切。因此可以通過(guò)對(duì)不同性別栝樓葉片內(nèi)的激素、多胺、可溶性糖含量以及一些酶的活性等生理、生化方面的差異來(lái)對(duì)栝樓的性別進(jìn)行鑒別。

孫永剛利用BTB、甲基紅和溴酚藍(lán)對(duì)栝樓的雌、雄株幼苗葉片的提取液進(jìn)行研究，結(jié)果表明雄株的反應(yīng)明顯比雌株深，分光光度計(jì)的研究結(jié)果同時(shí)顯示雌、雄株的染色液在特定波長(zhǎng)的吸光值差異顯著^[5]。李珊等測(cè)定雌、雄植株葉片生理生化指標(biāo)以及采用HPLC法對(duì)雌雄植株葉片化學(xué)成分進(jìn)行研究，結(jié)果表明雄株的光合色素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD活性、POD活性、DNA濃度高于雌株，其中光合色素的量、POD活性差異達(dá)顯著水平。雌株的MDA、可溶性糖、紫外吸收物的量高于雄株，其中紫外吸收物的量差異達(dá)顯著水平^[6]。郭曉亮用比色法研究了雌、雄栝樓幼苗葉片中水溶性酚類物質(zhì)、可溶性糖、還原性糖、抗壞血酸及光合色素等內(nèi)含物含量的差異，結(jié)果表明，雄性栝樓幼苗葉片中水溶性酚類物質(zhì)、葉綠素B及光合色素含量極顯著高于雌性栝樓；可溶性糖、抗壞血酸、葉綠素A、類胡蘿卜素等含量，雄性顯著高于雌性，而還原性糖含量雌性極顯著高于雄性^[7]。

曲超等利用酒石酸鐵和蒽酮比色法來(lái)對(duì)不同性別的栝樓生理、生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，在花期雌、雄株葉片在水溶性酚和可溶性糖含量上存在顯著差異，同時(shí)研究結(jié)果也顯示雌株葉片的還原性高于雄株葉片^[4]。劉蕓等在栝樓生長(zhǎng)發(fā)育各階段，采用高效液相色譜技術(shù)分別對(duì)雌、雄植株葉片內(nèi)源激素及多胺含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在所測(cè)定的生長(zhǎng)發(fā)育期，吲哚乙酸、亞精胺含量，雌株始終高于雄株；而脫落酸、精胺含量雌株始終低于雄株；玉米素核苷、赤霉素和腐胺含量在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期雄株高于雌株，雄株進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段后迅速下降^[8]。劉蕓等對(duì)栝樓雌、雄植株生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期的光合作用和蒸騰作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，栝樓雄株的光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和水分利用效率均大于雌株；雄株比雌株提前22 d進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段。當(dāng)雄株進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段后，其光合速率、蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度大于雌株，但水分利用效率略小于雌株^[9]。張偉等以4個(gè)地區(qū)的8個(gè)栝樓品系為材料，采用蒽酮比色法測(cè)定了不同栝樓品種開花期間葉片的可溶性糖含量，結(jié)果表明，不同產(chǎn)區(qū)的栝樓雌、雄株葉片中的可溶性糖在開花期不盡相同，認(rèn)為單純的從開花期葉片可溶性糖含量表現(xiàn)出差異的角度試圖揭示栝樓雌、雄差異的現(xiàn)象，進(jìn)而尋求對(duì)其進(jìn)行早期鑒別的技術(shù)可能比較困難^[10]。劉偉等采用陽(yáng)離子交換樹脂分離Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn 6種元素的游離態(tài)和非游離態(tài)，結(jié)果顯示雌、雄栝樓天花粉中的6種元素存在形態(tài)不一致，游離態(tài)和無(wú)機(jī)態(tài)為主要存在形式，雌、雄栝樓在元素形態(tài)上的差異僅存在于無(wú)機(jī)態(tài)的Ca和Mg^[11]。

2.3 分子標(biāo)記

于鳳池等對(duì)栝樓雌、雄株不同器官進(jìn)行過(guò)氧化物酶同工酶活性和電泳分析。結(jié)果表明，雌株的過(guò)氧化物酶同工酶活性高于雄株，且雌株葉片中有一條特異性的過(guò)氧化物酶同工酶譜帶；雄株花芽中存在一種23 400的特異蛋白質(zhì)，雄花中一種32 300的蛋白質(zhì)在受精后消失^[12]。李彥農(nóng)通過(guò)葉片總DNA抽提、RAPD標(biāo)記分析及反復(fù)的試驗(yàn)篩選。在80個(gè)RAPD引物中，用引物AN18擴(kuò)增得到一條約0.6 kb與雄性栝樓相連鎖的多態(tài)性片段（TKM647），對(duì)該片段進(jìn)行了克隆與序列分析，但是轉(zhuǎn)化SCAR標(biāo)記卻沒(méi)有成功^[13]。孫永剛在栝樓的雌、雄株之間進(jìn)行同工酶電泳，結(jié)果表明雌、雄株在過(guò)氧化物酶同功酶圖譜分析中共得到4條和性別相關(guān)的譜帶；多酚氧化酶同功酶則有3條與雌株有關(guān)的標(biāo)記。另一方面建立了可用于栝樓雌、雄鑒別的AFLP反應(yīng)體系，雌、雄集群間檢測(cè)到71個(gè)AFLP多態(tài)性標(biāo)記，其中40條來(lái)自雌株，31條來(lái)自雄株，分離比大約為1.3 ∶[KG-*3]1^[5]。Kumar等利用41對(duì)隨機(jī)引物分別對(duì)雌性、雄性和單性結(jié)實(shí)系的基因池進(jìn)行研究，結(jié)果顯示2個(gè)標(biāo)記OPC05-1000和OPC14-400能夠在雌、雄栝樓中穩(wěn)定擴(kuò)增出差異條帶，可以用于栝樓性別的鑒別^[14]。Seneviratne等利用幾百條RAPD引物對(duì)雌、雄栝樓的基因組進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果顯示引物OPC-7擴(kuò)增產(chǎn)生的1條564 bp的條帶能夠準(zhǔn)確地區(qū)分雌、雄株，并認(rèn)為雌、雄株之間差異性的條帶的發(fā)現(xiàn)將有助于在分子水平上了解雙子葉植物的性別決定^[15]。Roy等在栝樓性別發(fā)育時(shí)期采用cDNA-AFLP的方法對(duì)雌、雄栝樓的表達(dá)水平進(jìn)行研究，在雌雄株之間共有31個(gè)上調(diào)或下調(diào)的基因片段被選擇用于測(cè)序，其中23個(gè)來(lái)源于雄性，8個(gè)來(lái)源于雌性。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明其中一個(gè)來(lái)源于雄性的克隆，具有多聚半乳糖醛酸酶基因的功能，該基因參與花粉的發(fā)育、萌發(fā)以及在花粉管的伸長(zhǎng)過(guò)程中起解聚角質(zhì)的作用^[16]。郭曉亮對(duì)不同時(shí)期栝樓幼苗葉片中的醋酶、過(guò)氧化物酶、細(xì)胞色素氧化酶等同工酶進(jìn)行了電泳分析，結(jié)果表明，同一時(shí)期，不同性別的栝樓，同工酶在譜帶、酶含量上存在一定的差異；其中，酯酶同工酶中的特異性譜帶Rf 0.439在雄性栝樓苗期較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)表現(xiàn)比較明顯，可望作為栝樓苗期性別鑒別的特異性指標(biāo)^[7]。曲益濤利用92個(gè)隨機(jī)引物并選用優(yōu)化過(guò)的RAPD反應(yīng)體系對(duì)同一來(lái)源的栝樓組培后代雌、雄株DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)1條600 bp特異性條帶與雄性連鎖，將這一特異條帶最終成功實(shí)現(xiàn)RAPD轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。但是筆者所在研究室進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，當(dāng)采用不同來(lái)源的栝樓雌、雄株時(shí)，SCAR標(biāo)記卻未能有效地鑒別栝樓的雌、雄株^[17]。Kumar等利用RAPD引物對(duì)42個(gè)栝樓組培后代的雌、雄株以及單性結(jié)實(shí)系進(jìn)行分子鑒別研究，結(jié)果表明標(biāo)記OPC05-1000的條帶只存在于雄性栝樓的基因池中，標(biāo)記OPC14-400只存在雌性栝樓的基因池中，上述2個(gè)標(biāo)記能夠穩(wěn)定在開花前用于栝樓雌、雄株的鑒別^[18]。Nanda等利用40個(gè)ISSR引物對(duì)雌、雄性基因池進(jìn)行篩選，結(jié)果篩選到1個(gè)和雄性連鎖的720 bp標(biāo)記TdMSM，Southern雜交結(jié)果表明該標(biāo)記僅存在于雄性栝樓中，除此之外該標(biāo)記可以有效地區(qū)分未知性別的15個(gè)不同性別的栝樓^[19]，但是在筆者的研究中該標(biāo)記未能有效地鑒別栝樓雌、雄株。Karmakar等對(duì)二倍體栝樓雌、雄株塊根的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示：在還原性的SDS-PAGE電泳時(shí)，雌、雄株之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯條帶差異，只是存在條帶濃度的差異；然而當(dāng)使用15 μg的蛋白進(jìn)行非還原性電泳時(shí)，栝樓雌雄株之間出現(xiàn)條帶的有無(wú)以及強(qiáng)度差異^[3]。

3 展望

栝樓的性別表達(dá)由基因決定，因此利用分子生物學(xué)技術(shù)在基因表達(dá)水平上研究雌、雄株之間的差異性，從中找到性別差異的片段并進(jìn)行分析，從而建立栝樓性別分化的遺傳規(guī)律。但是栝樓的性別分化的差異歸根結(jié)底是表現(xiàn)在花器官上，花器官形成機(jī)理的研究將有助于了解其性別分化的形態(tài)發(fā)生過(guò)程和控制機(jī)理，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步了解其性別分化各時(shí)期中各種生理生化指標(biāo)的變化規(guī)律，將為栝樓的性別遺傳規(guī)律的研究提供切實(shí)的依據(jù)。目前一般認(rèn)為栝樓的性別分化主要受遺傳控制并且是嚴(yán)格的雌、雄異株植物，但是我們?cè)谧钚碌难芯恐袆t發(fā)現(xiàn)一些植物激素能夠使離體的栝樓組織性別發(fā)生變異[17，20]。與此同時(shí)，最新的研究結(jié)果表明番木瓜原始Y染色體的雄性特異區(qū)中DNA甲基化和異染色質(zhì)化參與番木瓜的性別發(fā)育過(guò)程，從而達(dá)到開啟或關(guān)閉一些和性別相關(guān)基因的表達(dá)最終來(lái)控制番木瓜的性別的分化^[21]。栝樓和番木瓜一樣同屬于雌雄異株植物，可能通過(guò)染色體區(qū)段的異染色質(zhì)化來(lái)調(diào)控栝樓的性別分化。也可能在外界激素的作用或組織培養(yǎng)條件下，可能通過(guò)開啟或關(guān)閉一些和花器官發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)來(lái)調(diào)控栝樓的性別分化。

綜上所述，一般認(rèn)為栝樓的性別的表達(dá)主要由遺傳決定，但是最近的研究結(jié)果表明，栝樓性別的表達(dá)除了受到遺傳控制之外，還受到一些激素等因素的影響，從而在受到外源激素的作用或在組織培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)花器官畸變和性別變異的現(xiàn)象。因此在未來(lái)的栝樓性別的研究過(guò)程中，除了主要從遺傳上來(lái)進(jìn)行研究外，還要充分考慮植物激素對(duì)栝樓花器官性別分化的影響。尤其是在組織培養(yǎng)過(guò)程中，栝樓莖尖分生組織有可能會(huì)由于激素的作用而不能保持外植體原有的性別的可能性。今后栝樓性別的研究方向?yàn)椋海?）構(gòu)建栝樓性別分化的無(wú)性系，研究植物激素對(duì)栝樓性別的影響。分別對(duì)栝樓雌株和雄株進(jìn)行離體組織培養(yǎng)，研究不同的植物激素對(duì)不同性別的無(wú)性系后代群體性別的影響，篩選合適的植物激素，從而避免栝樓在組織培養(yǎng)過(guò)程中性別容易發(fā)生變異的情況。（2）提高栝樓種子的發(fā)芽率，以便于深入研究栝樓雜交后代群體的性別表達(dá)的遺傳規(guī)律，為探討栝樓的性別分化的遺傳規(guī)律奠定基礎(chǔ)。（3）通過(guò)在基因水平上對(duì)不同性別的栝樓進(jìn)行研究，同時(shí)借鑒同屬于葫蘆科的模式植物黃瓜的性別分化的機(jī)理研究成果，來(lái)探索激素調(diào)控栝樓性別分化的可能機(jī)理。

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