上海奧星制藥技術(shù)裝備有限公司 王國振 趙 海 張 闖 石 紅(上海201600)

癃閉舒片是由補(bǔ)骨脂 、益母草、金錢草、海金沙、琥珀及山慈菇六味藥物組成的復(fù)方制劑 ，原工藝采用琥珀原粉入藥，其余補(bǔ)骨脂等五味藥材加水煎煮，濃縮，噴霧干燥，與琥珀原粉及適量輔料制得片劑。該藥的君藥為補(bǔ)骨脂，其有效成分為補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，原工藝提取補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素收率偏低，因此對原工藝進(jìn)行改進(jìn)制得癃閉舒片。為了進(jìn)一步控制其質(zhì)量，采用高效液相色譜法對制劑中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量進(jìn)行了測定，現(xiàn)報道如下。

1 試藥與儀器

高效液相色譜儀 (UltiMate 3000美國DIONEX公司);N-2000色譜工作站 (浙江大學(xué));TU-1900紫外分光光度計 (北京普析通用儀器有限公司);癃閉舒片 (石家莊科迪藥業(yè)有限公司);補(bǔ)骨脂素對照品 (批號:110739–200910，中國藥品生物制品檢定所);異補(bǔ)骨脂素對照品 (批號:110738-200811，中國藥品生物制品檢定所);乙腈和甲醇為色譜純;水為超純水;其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝優(yōu)化

2.1.1 色譜條件:色譜柱，Kromasil 100A C185 μm 4.6×250 mm;柱溫:室溫;流動相:甲醇-水 (55︰45);流速:1.0 mL/min;檢測波長:246 nm;理論塔板數(shù)以按補(bǔ)骨脂素峰計算應(yīng)不低于5 000。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:補(bǔ)骨脂素分別配成5.2、10.4、20.8、41.6和83.2μg/mL溶液，異補(bǔ)骨脂素分別配成5.1、10.2、20.4、40.8和81.6 μg/mL溶液。分別精密量吸取上述對照品溶液各10 μL，在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，測定峰面積。以對照品進(jìn)樣量 (μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)作圖，得到:補(bǔ)骨脂的回歸方程為:Y=895 462X-16 859，r=0.999 9，在0.052～0.832 μg范圍內(nèi)，補(bǔ)骨脂素進(jìn)樣量與峰面積值呈良好的線性關(guān)系;異補(bǔ)骨脂的回歸方程為:Y=76 295X-86 904，r=0.999 9，在0.051～0.816 μg范圍內(nèi)，異補(bǔ)骨脂素進(jìn)樣量與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 供試品的制備:取相當(dāng)于0.5 g藥材的提取液，蒸干，加甲醇適量溶解，轉(zhuǎn)移置具塞容量瓶中，精密加甲醇至25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜 (0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 單因素考察和正交優(yōu)化提取工藝 原工藝:補(bǔ)骨脂、益母草、金錢草、海金沙及山慈菇五味藥材加水煎煮，濃縮，噴霧干燥，與琥珀原粉及適量輔料制得片劑。新工藝:補(bǔ)骨脂單獨乙醇提取，回收乙醇至無醇味，備用;益母草、金錢草、海金沙及山慈菇四味藥材與補(bǔ)骨脂藥渣加水煎煮，濾液與上述濃縮液合并濃縮，噴霧干燥，與琥珀原粉及適量輔料制得片劑。

2.2.1 單因素考察:(1)提取次數(shù)對指標(biāo)成分影響，將提取時間固定為1 h，加乙醇量為8倍，分別提取1、2、3、4，5次，考察了不同提取次數(shù)對指標(biāo)成分的影響。結(jié)果在提取3次以后，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量很少，因此最多提取3次。(2)提取時間對指標(biāo)成分影響，將提取次數(shù)固定為3次，加乙醇量為8倍，每次分別提取0.5、1、1.5、2 h，考察了不同提取時間對指標(biāo)成分的影響。結(jié)果每次提取1 h，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量基本提取完全，因此每次提取1 h。(3)溶劑用量對指標(biāo)成分影響，將提取次數(shù)固定為3次，提取時間為1 h，每次分別加6、8、10、12倍量乙醇，考察了不同溶劑用量對指標(biāo)成分的影響。結(jié)果溶劑用量對指標(biāo)成分影響不大，考慮生產(chǎn)成本，選擇8倍量乙醇。(4)乙醇濃度對指標(biāo)成分影響，將提取次數(shù)固定為3次，提取時間為1 h，加8倍量乙醇，分別用50%、60%、70%、80%乙醇提取，考察了不同濃度的乙醇對指標(biāo)成分和出膏率的影響。綜合評價后70%乙醇提取效果基本完全。

2.2.2 正交設(shè)計篩選最優(yōu)提取工藝:稱取100 g補(bǔ)骨脂藥材9份，結(jié)合文獻(xiàn)及單因素預(yù)試驗，選定補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素為考察指標(biāo)成分，運用正交試驗的方法，對主要影響因素:加乙醇量 (A)、時間 (B)、次數(shù) (C)、醇提濃度 (D)考察。

2.2.2.1 實驗設(shè)計:［1］運用正交設(shè)計試驗，以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素為考察指標(biāo)成分，結(jié)合文獻(xiàn)、工業(yè)生產(chǎn)及預(yù)試驗，確定4因素3水平，見表1。

表1 提取條件因素-水平設(shè)計

2.2.2.2 方法與結(jié)果:按表1設(shè)計操作，按供試品處理下列樣品即得。結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果

2.2.2.3 結(jié)果分析:對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，見表3。

表3 方差分析表

由表2直觀分析表可知，各考察因素對補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素影響大小順序為C＞B＞D＞A;表3方差分析，表明提取時間和提取次數(shù)對補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量影響顯著，因此選擇提取3次，每次1.5 h;直觀分析，醇提濃度和溶劑用量對補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量影響不大。因此選擇醇提濃度為60%和80%時，含量相差不大，考慮生產(chǎn)成本，因此選定60%乙醇提取，溶劑用量選擇6倍量乙醇;因此，最后確定工藝為:回流提取3次，每次1.5 h，每次加6倍量乙醇，醇提濃度為60%。并驗證結(jié)果，見表4。

表4 工藝比較表

提取工藝確定:補(bǔ)骨脂單獨乙醇提取，回收乙醇至無醇味，備用;益母草、金錢草、海金沙及山慈菇四味藥材與補(bǔ)骨脂藥渣加水煎煮，濾液與上述濃縮液合并濃縮，噴霧干燥，與琥珀原粉及適量輔料制得片劑。

2.3 成品中補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素含量測定［2］

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性:色譜柱，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;柱溫，25℃;流動相，乙腈-水 (32︰68);流速，1.0 mL/min;檢測波長，246 nm。理論板數(shù)按補(bǔ)骨脂素峰計算應(yīng)不低于5 000。

2.3.2 干擾性試驗:按照處方制備不含補(bǔ)骨脂的陰性樣品，按擬定的含量測定方法制備陰性對照液，進(jìn)樣分析，結(jié)果在對照品溶液和供試品溶液補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素峰相同保留時間位置陰性未見有峰干擾，說明癃閉舒片中其他藥材及輔料對本方法測定補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量無干擾。

2.3.3 線性關(guān)系試驗: (1)對照品溶液制備，分別取補(bǔ)骨脂素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為2.6、5.2、10.4、20.8、41.6 μg/mL的溶液;分別取異補(bǔ)骨脂素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為2.7、5.4、10.8、21.6、43.2 μg/mL的溶液，分別吸取上述兩種對照品溶液下不同濃度補(bǔ)骨脂素異和補(bǔ)骨脂素10 μL，進(jìn)樣分析。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線，在上述色譜條件下，記錄色譜圖，測定峰面積。以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對照品進(jìn)樣量 (μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)作圖，得到:①補(bǔ)骨脂素回歸方程為，Y=171 627X-25 325，r=0.999 9，在 0.026 ～0.416 μg范圍內(nèi)，補(bǔ)骨脂素進(jìn)樣量與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。②異補(bǔ)骨脂素回歸方程為，Y=324 556X-187 905，r=0.999 9，在 0.027 ～0.432 μg范圍內(nèi)，異補(bǔ)骨脂素進(jìn)樣量與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4 精密度試驗:精密吸取含補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素分別為10 μg/mL的對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積，結(jié)果見表5、表6。

表5 補(bǔ)骨脂素對照品精密度試驗結(jié)果

表6 異補(bǔ)骨脂素對照品精密度試驗結(jié)果

試驗結(jié)果表明:精密度良好，補(bǔ)骨脂RSD為0.39%，異補(bǔ)骨脂RSD為1.3%。

2.3.5 溶液穩(wěn)定性試驗: 稱取樣品約0.3 g，精密稱定，照確定的方法制備供試品溶液，取上述供試液，分別于0、2、4、8和14 h時，進(jìn)樣10 μL，測得樣品中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素峰面積，結(jié)果見表7、表8。

表7 供試品溶液補(bǔ)骨脂素穩(wěn)定性試驗結(jié)果

表8 供試品溶液異補(bǔ)骨脂素穩(wěn)定性試驗結(jié)果

試驗結(jié)果證明，樣品溶液在14 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

2.3.6 重復(fù)性試驗:按擬定的含量測定方法，對同一批樣品，分別制備5份供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，測定峰面積值總和并計算含量，結(jié)果見表9。

表9 樣品重復(fù)性試驗結(jié)果

2.3.7 回收率試驗:稱取已知含量的樣品約0.15 g，平行9份，其中3份分別加入濃度為含0.25 mg/mL補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對照品溶液各1 mL，3份分別加入含0.4 mg/mL補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對照品溶液各1 mL，3份分別加入0.55 mg/mL的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對照品溶液各1 mL，照“供試品溶液制備”項下操作，測定，以下式計算方法的回收率，結(jié)果見表10。回收率%=測得總量-樣品含量/加入量×100%。

表10 回收率試驗結(jié)果

試驗結(jié)果表明:平均回收率為100.17%，RSD為1.6%，加樣回收率良好。

3 討論

補(bǔ)骨脂在癃閉舒片中作為君藥，其主要有效成分為補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，因補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素是脂溶性成分，采用水提取補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，收率偏低，影響藥效;筆者采取單獨乙醇提取補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，補(bǔ)骨脂藥渣與其他藥材合并水提取，這樣每片癃閉舒片中含有補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含量總和比原工藝比較提高25%，藥效試驗正在進(jìn)行中。

［1］國家藥典委員會.中國藥典 (一部)［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010.1 226-1 227

［2］周海嬰.RP-HPLC柱前衍生法測定復(fù)方甘草酸銨S分散片的含量 ［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2009，30(12):28-30