陳 明 段 萍 徐作剛 萬(wàn)紅才

1.黔南州民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，貴州 都勻 558000;2.黔南州食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 都勻 558000

烏蕨Stenoloma chusanum(L.)Ching為鱗始蕨科烏蕨屬的多年生草本植物，別名烏韭、石發(fā)、土川連、孔雀尾、大葉金花草、小葉野雞尾、蜢蚱參、細(xì)葉鳳凰尾等，分布較為廣泛，是一種常見(jiàn)的中草藥。其具有一定的抗菌活性，有“萬(wàn)能解毒藥”之稱［1-3］。烏蕨中含有葒草苷、葒草苷-2-O-B-D-吡喃葡萄糖苷、牡荊素、芹菜素、丁香酸、原兒茶酸、原兒茶醛、香草酸和龍膽酸等化合物。目前采用紫外分光光度法測(cè)定烏蕨中總黃酮、總酚酸含量［4-7］。未見(jiàn)報(bào)道測(cè)定原兒茶酸、原兒茶醛的含量。為此，本文采用HPLC法測(cè)定烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-2010A高效液相色譜儀;Agilent1260高效液相色譜儀;島津2401紫外分光光度計(jì);SK250LHC超聲波清洗器 (上?？茖?dǎo)儀器有限公司);梅特勒AG135、AL204電子天平。

1.2 試劑與材料 原兒茶酸 (批號(hào):0809-200604)、原兒茶醛 (批號(hào):110810-200506)對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;乙腈 (色譜純)、水為娃哈哈純凈水、其余試劑均為分析純。烏蕨樣本共7批，自然干燥10天后，地下部分洗凈，全草于90℃干燥5小時(shí)，取地上部分、地下部分分別粉碎，過(guò)10目篩，即得供試樣品，見(jiàn)表1。

表1 烏蕨樣本采集表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［8-13］色譜柱:迪馬 Diamonsil ODS C18(4.6mm × 150mm，5μm)、Agilent ODS C18(4.6mm ×250mm，5μm);流動(dòng)相:0.4%磷酸溶液 (A)-乙腈(B)，梯度洗脫，0～20min，98%-92%A;20～35min，92%-98%A;35～40min，98%A;流速:1.0ml/min;進(jìn)樣量:5μl;柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):280nm。理論板數(shù)以原兒茶醛峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2 對(duì)照品溶液配制 精密稱取原兒茶酸、原兒茶醛對(duì)照品適量，加65%乙醇制成每1ml含原兒茶酸0.08mg、原兒茶醛0.03mg的溶液。

2.3 供試品溶液配制［14、15］取供試樣品約2.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入65%乙醇50ml，稱定重量，加熱回流60分鐘，放冷，再稱定重量，用65%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 峰純度考察 取對(duì)照品溶液、供試品溶液各5μl，分別注入液相色譜儀，依法測(cè)定。結(jié)果表明:對(duì)照品原兒茶醛的紫外掃描圖在280nm處有最大吸收，原兒茶酸的紫外掃描圖在260nm處有最大吸收，在280nm處有較大吸收。烏蕨供試液中原兒茶酸、原兒茶醛峰的紫外掃描圖與對(duì)照品原兒茶酸、原兒茶醛峰的紫外掃描圖譜一致，且達(dá)到純度要求。

2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取原兒茶酸10.11mg置10ml量瓶中，加65%乙醇溶解并稀釋至刻度，精密量取2ml置25ml量瓶中，加65%乙醇溶解并稀釋至刻度;原兒茶醛對(duì)照品10.05mg置100ml量瓶中，加65%乙醇溶解并稀釋至刻度，精密量取3ml置10ml量瓶中，加65%乙醇溶解并稀釋至刻度，得原兒茶酸 (0.08088mg/mL)、原兒茶醛(0.03015mg/ml)對(duì)照品溶液。精密吸取原兒茶酸、原兒茶醛對(duì)照品溶液2、5、8、10、15μl，注入液相色譜儀，按“2.1項(xiàng)”下的色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量數(shù) (μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，原兒茶酸、原兒茶醛線性回歸方程分別為:A=1731800.51C-787.30(r=0.99996)、A=46117473.35C-1951.57(r=0.99996)。且原兒茶酸在0.1618-1.213μg/ml內(nèi)呈良好的線性關(guān)系;原兒茶醛在0.06030-0.4522μg/ml內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度考察 精密吸取“2.5項(xiàng)”下原兒茶酸、原兒茶醛對(duì)照品溶液5μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，原兒茶酸、原兒茶醛峰面積的RSD分別為0.10%、1.06%，結(jié)果表明此方法有良好的精密度。

2.7 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液分別于0、4、8、12、16、24h進(jìn)樣，進(jìn)樣量5μl，測(cè)定原兒茶酸、原兒茶醛峰面積，原兒茶酸、原兒茶醛峰面積的 RSD分別為0.89%、1.22%，說(shuō)明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性考察 取供試樣品，按“2.3項(xiàng)”下方法配制6份供試品溶液，按“2.1項(xiàng)”下方法，測(cè)定峰面積。原兒茶酸、原兒茶醛的平均含量為2.0938mg/g、0.9221mg/g，RSD分別為1.74%、0.78%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已測(cè)定含量的樣品1.0g(原兒茶酸、原兒茶醛的平均含量為2.0938mg/g、0.9221mg/g)，置具塞錐形瓶中，精密加入原兒茶酸、原兒茶醛混合對(duì)照品溶液［精密稱取原兒茶醛對(duì)照品10.05mg，置100mL量瓶中，精密量取50ml置500ml量瓶中，另精密稱取原兒茶酸對(duì)照品10.33mg置同一500ml量瓶中，加65%乙醇溶解并稀釋至刻度，制得原兒茶酸、原兒茶醛混合對(duì)照品溶液 (0.02066mg/ml、0.01005 mg/ml)］50ml，稱定重量，加熱回流60分鐘，放冷，再稱定重量，用65%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，進(jìn)樣5μl，記錄色譜圖，另取“2.5項(xiàng)”下原兒茶酸、原兒茶醛對(duì)照品溶液 5μl，同法測(cè)定。平均回收率分別為 96.70%，96.18%;RSD分別為1.30%，1.10%。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品測(cè)定 取供試樣品 (地上部分與地下部分)分別配制供試品溶液，進(jìn)樣5μl，記錄峰面積，測(cè)定含量。見(jiàn)表3、表4。

表3 烏蕨 (地上部分)原兒茶酸、原兒茶醛測(cè)定結(jié)果 (n=3)mg/g

表4 烏蕨 (地下部分)原兒茶酸、原兒茶醛測(cè)定結(jié)果 (n=3)mg/g

3 討論

3.1 采挖季節(jié)對(duì)烏蕨中原兒茶酸、原兒茶醛的含量有影響，冬季原兒茶酸、原兒茶醛含量下降約一半;地上部分含原兒茶酸、原兒茶醛的含量比地下部分高約1倍以上。

3.2 比較65%乙醇、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮作溶劑，加熱回流1小時(shí)制備的供試品溶液，以65%乙醇制備的供試品溶液所測(cè)原兒茶酸、原兒茶醛的含量最高;65%乙醇作溶劑，加熱回流與超聲各1h，加熱回流所測(cè)原兒茶酸、原兒茶醛的含量較高。

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