胡云霞，李琬聰，周婷婷，郭占勇

（1.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所 海岸帶生物學(xué)與生物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái)264003；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

菊糖廣泛存在于30 000多種植物中，是一種天然的、可生物降解的植物性多糖[1－2］，在菊苣、菊芋、雪蓮果、大麗花等菊科植物的塊根塊莖中儲(chǔ)量較為豐富[3］。通過(guò)對(duì)菊糖高附加值利用的研究，可以提高菊糖的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，研發(fā)新型農(nóng)業(yè)殺菌劑，減輕環(huán)境污染，改善人們生活質(zhì)量，調(diào)動(dòng)人們種植菊芋等鹽生植物的積極性，推動(dòng)生態(tài)環(huán)境的修復(fù)和利用。國(guó)內(nèi)外對(duì)于菊糖的研究大多集中在菊糖的提取純化、菊糖自身的生理功能等方面，對(duì)于菊糖化學(xué)修飾的研究也多為酯化、醚化、羧甲基化等作為表面活性劑應(yīng)用于洗滌劑等日用化工行業(yè)[4－5］，關(guān)于菊糖衍生物作為農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中抗菌劑、殺菌劑的應(yīng)用鮮有報(bào)道。

席夫堿的基本結(jié)構(gòu)中含有亞胺（－CH＝N）結(jié)構(gòu)，可通過(guò)活潑的羰基與氨基反應(yīng)得到，其特有的化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予席夫堿優(yōu)良的生物化學(xué)活性，廣泛應(yīng)用于抗菌劑、消炎劑等的合成[6］。

1，2，3－三氮唑類氮雜環(huán)化合物具有廣泛的生物活性，在抗真菌、抗細(xì)菌、抗HIV以及治療關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)性精神錯(cuò)亂和惡性腫瘤方面有顯著療效[7］，廣泛應(yīng)用于DNA、RNA、多肽和糖類等化合物的結(jié)構(gòu)改造中，并表現(xiàn)出良好的效果。

鑒于此，作者根據(jù)活性疊加原理，首先利用丙炔胺與水楊醛及其鹵代衍生物合成席夫堿中間體，然后再通過(guò)Huisgen－Click反應(yīng)（即一價(jià)銅鹽催化端基炔和疊氮化合物發(fā)生1，3－偶極環(huán)加成生成1，4－二取代1，2，3－三氮唑的反應(yīng)[8－9］），將中間體與疊氮代菊糖分子通過(guò)1，2，3－三氮唑橋連，最后對(duì)橋連產(chǎn)物脫乙?；玫胶?，2，3－三氮唑和席夫堿官能團(tuán)的新型菊糖衍生物（4a～4c），并測(cè)定其抑菌活性、評(píng)價(jià)其殺菌性能，為尋找環(huán)境友好、低毒、安全、高效的生物抑菌制劑提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

菊糖（純度≥90%），北京威德生物科技有限公司。

黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum lagenarium）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium）、蘆筍莖枯病菌（Phomopsis asparagi）均來(lái)自青島農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

丙炔胺、水楊醛、5－氯水楊醛、5－溴水楊醛、N－溴代丁二酰亞胺（NBS）、三苯基膦（PPh3）、疊氮鈉（NaN3）、三乙胺（Et3N）、乙酸酐（Ac2O）、N，N－二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）等合成實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純；真菌培養(yǎng)基、瓊脂粉等活性實(shí)驗(yàn)所用試劑均為生化純；多菌靈。

XS10500型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；MF－D105型恒溫油浴鍋，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；FD－1C－80型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FTIR－6300型紅外光譜儀，日本Jasco公司；SWCJ－2F型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰有限責(zé)任公司；LOZX－50KB型高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SHZ－B型水浴恒溫振蕩器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 合成路線（圖1）

圖1 目標(biāo)化合物4a～4c的合成路線Fig.1 Synthetic route of target compounds 4a～4c

1.2.2 合成方法

1）水楊醛類丙炔胺席夫堿（1a～1c）的合成[10］

分別取水楊醛、5－氯水楊醛、5－溴水楊醛10mmol溶于50mL乙醇中，攪拌，恒壓緩慢滴加10mmol丙炔胺，于70℃水浴回流反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后靜置冷卻，待結(jié)晶后過(guò)濾，冷凍干燥，得化合物1a～1c。

2）C－6脫氧疊氮代乙酰化菊糖衍生物（2）的合成[11－12］

取10mmol菊糖、50mmol NBS溶于100mL DMF中，冰浴條件下攪拌至溶解完全；取50mmol PPh3溶于50mL DMF中，緩慢加入反應(yīng)液中，冰浴條件下繼續(xù)攪拌20min，然后置于80℃油浴中反應(yīng)3 h；用丙酮沉淀，洗滌，抽濾，將所得產(chǎn)物溶于100mL吡啶中，加入15mL乙酸酐，室溫反應(yīng)12h；用冰水沉淀，洗滌，索氏提取36h，冷凍干燥，得C－6脫氧溴代乙?；仗牵蝗?0mmol溶于100mL DMF中，加入15 mmol NaN3，于80℃反應(yīng)4h；用冰水沉淀，洗滌，索氏提取36h，冷凍干燥，得化合物2。

3）1，2，3－三氮唑橋連水楊醛類席夫堿乙酰化菊糖衍生物（3a～3c）的合成[12］

取10mmol化合物2溶于150mL DMSO中，然后加入1mmol CuI和10mmol Et3N，于70℃油浴條件下攪拌，用恒壓漏斗分別滴加15mmol化合物1a～1c，惰性氣體保護(hù)，攪拌48h，反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫，用乙醚－異丙醇（3∶1）400mL沉淀，抽濾，用水洗滌，冷凍干燥，得化合物3a～3c。

4）1，2，3－三氮唑橋連水楊醛類席夫堿菊糖衍生物（4a～4c）的合成

分別取1mmol化合物3a～3c于10mL 2mmol·mL－1的 MeOH／MeONa溶液中，室溫?cái)嚢?h，抽濾，甲醇洗滌，冷凍干燥，得目標(biāo)化合物4a～4c。

1.2.3 紅外光譜分析

采用KBr壓片法，在4 000～400cm－1范圍內(nèi)掃描，進(jìn)行紅外光譜分析。

1.2.4 抑菌活性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[13］研究目標(biāo)化合物4a～4c在濃度分別為1 000μg·mL－1、500μg·mL－1、100 μg·mL－1時(shí)對(duì)黃瓜炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、蘆筍莖枯病菌的抑制活性：將冰箱內(nèi)保存的菌種經(jīng)2次轉(zhuǎn)管復(fù)壯后備用，用直徑5mm的打孔器在新鮮菌落的外圍打取菌餅接種；然后置于27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h或72h后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑（D）。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2次，以商品化多菌靈為對(duì)照藥劑，等量蒸餾水為空白對(duì)照。依下式計(jì)算抑菌率：

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

菊糖、化合物2、3a～3c以及目標(biāo)化合物4a～4c的紅外光譜如圖2所示。

圖2 菊糖、化合物2、3a～3c、4a～4c的紅外光譜Fig.2 FTIR Spectra of inulin，compound 2，3a～3c，4a～4c

從圖2可知：菊糖骨架的特征峰為848cm－1、1 029cm－1和3 390cm－1；與菊糖相比，化合物2紅外光譜中新增加的2 105cm－1處的吸收峰為疊氮基的強(qiáng)烈振動(dòng)峰[14］，1 735cm－1處為乙酸酐保護(hù)后引入的乙酰基的特征吸收峰[15］；當(dāng)疊氮代乙酰菊糖與水楊醛類丙炔胺席夫堿中間體通過(guò)1，2，3－三氮唑橋連后，化合物3a～3c紅外光譜中疊氮基2 105cm－1處的強(qiáng)烈振動(dòng)峰消失，同時(shí)在1 527～1 531cm－1、1 461～1 465 cm－1、713～821cm－1、651～659cm－1范圍內(nèi)出現(xiàn)振動(dòng)吸收，推斷為苯環(huán)和三唑環(huán)的振動(dòng)疊加特征峰[12－15］，1 627～1 631cm－1處出現(xiàn)席夫堿－CH＝N基團(tuán)的特征吸收峰[16］，1 041～1 045cm－1處的吸收峰與化合物2相比明顯增強(qiáng)，推斷為1，2，3－三氮唑上與菊糖C－6位相連的C－N的特征吸收峰；用MeOH／MeONa脫保護(hù)后，化合物4a～4c的紅外光譜中1 735cm－1左右的吸收峰消失，其它特征峰沒(méi)有明顯變化。證明水楊醛類丙炔胺席夫堿已經(jīng)通過(guò)Huisgen－Click反應(yīng)與菊糖橋連生成含1，2，3－三氮唑的水楊醛類席夫堿的菊糖衍生物。

2.2 目標(biāo)化合物4a～4c的抑菌活性

不同濃度下，菊糖、化合物4a～4c對(duì)黃瓜炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、蘆筍莖枯病菌的抑菌率如圖3所示。

圖3 菊糖、化合物4a～4c對(duì)黃瓜炭疽病菌（a）、西瓜枯萎病菌（b）、蘆筍莖枯病菌（c）的抑菌活性Fig.3 Antifungal activities of inulin，compound 4a～4cagainst Colletotrichum lagenarium（a），F(xiàn)usarium oxysporium（b），Phomopsis asparagi（c）

從圖3可看出，菊糖沒(méi)有明顯的抑菌活性，而目標(biāo)化合物4a～4c的抑菌活性明顯強(qiáng)于菊糖，且隨著濃度的增大逐漸增強(qiáng)?；衔?a的抑菌活性最好，500μg·mL－1時(shí)，對(duì)3種植物真菌的抑制率分別為40.5%、33.3%、41.9%，高 于 菊 糖 的 8.3%、6.2%、9.7%；1 000μg·mL－1時(shí)，對(duì)3種植物真菌的抑菌率分別達(dá)66.7%、42.0%、58.1%，遠(yuǎn) 高 于 菊 糖 的 8.3%、11.3%、9.9%。化合物4a～4c對(duì)黃瓜炭疽病菌的抑菌活性強(qiáng)于西瓜枯萎病菌和蘆筍莖枯病菌。在500 μg·mL－1和1 000μg·mL－1時(shí)，化合物4a～4c對(duì)3種植物真菌的抑菌活性均強(qiáng)于菊糖。

2.3 討論

Huisgen－Click反應(yīng)一般需要疊氮基和端基炔2個(gè)配體。本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)溴代激活菊糖C－6位的羥基，使其變成易離去基團(tuán)，然后疊氮基進(jìn)攻易離去基團(tuán)，發(fā)生SN親核置換反應(yīng)，將溴取代得到疊氮代配體。

菊糖是一種多羥基化合物，具有較強(qiáng)的吸濕性、水溶性，在大多數(shù)有機(jī)溶劑中的溶解性均十分優(yōu)良，增大了反應(yīng)后處理的難度，同時(shí)也降低了產(chǎn)率。為了解決該問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)先采用“一鍋法”利用乙酸酐對(duì)溴代菊糖上的極性羥基進(jìn)行乙?；Ｗo(hù)，制備得到疏水性溴代乙?；仗茄苌铮沟梅磻?yīng)后處理過(guò)程中可以對(duì)產(chǎn)物直接用水沉淀并且洗滌，大大提高了反應(yīng)中間體的產(chǎn)率；然后再利用 MeOH／MeONa對(duì)1，2，3－三氮唑橋連水楊醛類席夫堿乙酰化菊糖衍生物脫乙?；?，釋放羥基，增大目標(biāo)產(chǎn)物的極性，以使其更好地分散于水中，有利于發(fā)揮抑菌活性。

由抑菌結(jié)果可以看出，不同鹵素取代基的抑菌活性相差不大，且低于不含鹵素衍生物的抑菌活性。表明，芳環(huán)上取代基的吸電子效應(yīng)對(duì)化合物抑菌活性的提高沒(méi)有明顯作用。在菊糖分子中引入席夫堿和1，2，3－三氮唑，可以明顯提高菊糖對(duì)真菌的抑制活性，實(shí)現(xiàn)活性疊加的目的。這一結(jié)果與有關(guān)席夫堿和1，2，3－三氮唑能夠提高化合物抑菌活性的報(bào)道相吻合[17－18］。

3 結(jié)論

采用化學(xué)方法對(duì)菊糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，通過(guò)1，2，3－三氮唑橋連水楊醛類席夫堿于菊糖分子中得到新型三氮唑類菊糖衍生物，其抑菌活性相比于菊糖有明顯提高。該研究不僅為環(huán)境友好型農(nóng)業(yè)殺菌劑的開發(fā)提供了參考依據(jù)，而且為菊糖的高值化利用開辟了新的領(lǐng)域，有助于推動(dòng)菊芋的種植開發(fā)，提高鹽堿地的利用率。

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