劉振華，聶永芳，周晨妍，孫景博，郭偉云

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 河南省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與分子靶向藥物高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，河南 新鄉(xiāng)453003；2.河南科技學(xué)院機(jī)電學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453003）

真菌在自然界非常普遍，但大多數(shù)都是非致病的。一些致病性真菌一般也僅引起手足頭癬等淺表病害，容易治愈。從20世紀(jì)70年代開(kāi)始，大量藥物被用于癌癥和艾滋病等臨床治療，導(dǎo)致病人免疫力下降，深部真菌感染疾病的死亡率逐漸上升[1］。深部真菌病的病原菌主要為念珠菌屬，其次為曲霉屬、酵母菌屬、霉菌屬等[2］。臨床上真菌感染率的上升導(dǎo)致抗真菌藥物使用率的升高，進(jìn)而使得耐藥菌株也不斷增多，造成臨床治療的困難[3］。兩性霉素B曾經(jīng)一直是治療真菌感染的一線藥物，但其副作用很大（包括腎毒性及其注射帶來(lái)的不良反應(yīng)）[4］。三唑類藥物（化學(xué)合成藥）有較好的療效和相對(duì)較低的毒性，但是因長(zhǎng)期使用已引起部分真菌的耐藥性。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新的抗真菌藥物。

芽孢細(xì)菌Gracilibacillus ureilyticus是一株在鹽堿土壤中新發(fā)現(xiàn)和鑒定的菌株[5］，研究表明其發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的活性組分對(duì)白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有抑制作用，其中對(duì)白色念珠菌的抑菌活性較強(qiáng)，可能成為新型的抗真菌抗生素。因此，作者在此研究極端環(huán)境細(xì)菌Gracilibacillus ureilyticus活性物質(zhì)大孔吸附樹(shù)脂脫色和離子交換樹(shù)脂提取工藝條件，旨在優(yōu)化其提取分離工藝，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、培養(yǎng)基與儀器

芽孢細(xì)菌Gracilibacillus ureilyticus，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），其發(fā)酵液經(jīng)絮凝去除菌體后備用。

檢驗(yàn)菌為白色念珠菌。

沙堡氏固體培養(yǎng)基：蛋白胨10g，葡萄糖40g，瓊脂20g，蒸餾水1 000mL，調(diào)pH 值至5.4～5.8，115℃高壓蒸氣滅菌30min。

沙堡氏液體培養(yǎng)基：除不加瓊脂外，配方同上。

大孔吸附樹(shù)脂D101，天津瑞金特化學(xué)品有限公司；大孔吸附樹(shù)脂XAD18、Amberlite離子交換樹(shù)脂F(xiàn)PC22H、FPC3500、FPA51、FPA90CL，美國(guó)陶氏公司。

SENCO R－205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；PH070A型恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS－3C型pH計(jì)，上海雷磁儀器廠。

1.2 方法

參照文獻(xiàn)[6］按以下步驟進(jìn)行提取：發(fā)酵絮凝液→大孔吸附樹(shù)脂脫色→離子交換樹(shù)脂提取→氨水洗脫→粗提液→減壓蒸餾→粗制品。

1.2.1 大孔吸附樹(shù)脂脫色

各取10.0g大孔吸附樹(shù)脂XAD18和D101，分別裝入直徑15.0mm的層析柱中，然后加入200.0mL發(fā)酵絮凝液，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。流出液每20.0mL接1管，觀察顏色變化并測(cè)活；吸附后的樹(shù)脂依次用120.0 mL水、25%乙醇、75%乙醇、100%乙醇和丙酮洗脫；將含有機(jī)溶劑的洗脫液濃縮后再溶于水，觀察洗脫液顏色并測(cè)活。

1.2.2 離子交換樹(shù)脂提取

1）靜態(tài)吸附

將發(fā)酵絮凝液 pH 值分別調(diào)為 3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，各取30.0mL置于燒瓶中，分別用4種離子交換樹(shù)脂（FPC22H、FPC3500、FPA51、FPA90CL）進(jìn)行靜態(tài)吸附，觀察絮凝液的顏色并測(cè)活，確定合適的離子交換樹(shù)脂。

吸附后的FPC22H樹(shù)脂依次用水、70%乙醇和1.0mol·L－1HCl溶液洗脫，吸附后的FPA51樹(shù)脂依次用水、70%乙醇和0.5mol·L－1氨水洗脫。記錄洗脫液的pH值并測(cè)活。

2）動(dòng)態(tài)吸附

分別取300.0mL發(fā)酵絮凝液加入到裝有10.0g FPC22H樹(shù)脂的2個(gè)層析柱中進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，每30.0 mL接1管，共接10管，其中一個(gè)層析柱依次用0.05 mol·L－1和0.5mol·L－1的氨水洗脫，測(cè)定抑菌活性。另外一個(gè)層析柱，吸附后先依次用30.0mL水和180.0mL 25%、50%和70%的乙醇洗脫，然后再用180.0mL 0.0005mol·L－1、0.005mol·L－1、0.05 mol·L－1和0.5mol·L－1氨水洗脫，觀察顏色變化。

1.3 抑菌活性測(cè)定方法

1）將冰箱中保存的白色念珠菌用沙堡氏固體培養(yǎng)基活化（37℃生長(zhǎng)24h），然后接種到沙堡氏液體培養(yǎng)基中，于37℃、200r·min－1培養(yǎng)12h。

2）吸取一定量的白色念珠菌培養(yǎng)液于沙堡氏固體培養(yǎng)基平皿內(nèi)，搖動(dòng)平皿使培養(yǎng)液均勻分布，用移液器取出多余部分，將平皿開(kāi)蓋晾干，制成含菌平皿。

3）用直徑為6mm的無(wú)菌打孔器在固體培養(yǎng)基平皿上打孔，將100μL待測(cè)樣品液注入孔內(nèi)，37℃恒溫培養(yǎng)，每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)重復(fù)對(duì)照。

4）24h后測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔吸附樹(shù)脂脫色

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：XAD18樹(shù)脂吸附后的流出液每管都有一定活性，水、25%乙醇和75%乙醇洗脫液活性很弱，100%乙醇和丙酮洗脫液無(wú)活性。表明XAD18樹(shù)脂對(duì)活性物質(zhì)有微弱吸附作用，且易被洗脫。

D101樹(shù)脂吸附后流出液每管都無(wú)活性，說(shuō)明D101樹(shù)脂對(duì)活性物質(zhì)有一定吸附能力；水洗脫液有活性，乙醇和丙酮洗脫液無(wú)活性，說(shuō)明該類活性物質(zhì)可以被水洗脫。該類物質(zhì)的極性比水小、比乙醇等有機(jī)溶劑大，分析其可能為離子型化合物，所以下一步用離子交換樹(shù)脂分離提取。

比較XAD18和D101兩種樹(shù)脂對(duì)色素的吸附能力發(fā)現(xiàn)，D101樹(shù)脂可以吸附更多的色素，所以后續(xù)分離提取工藝采用D101大孔吸附樹(shù)脂脫色，然后進(jìn)行離子交換樹(shù)脂提取。為充分利用D101樹(shù)脂的脫色能力，絮凝液和D101樹(shù)脂的比例以10mL∶1g較為適宜。

2.2 離子交換樹(shù)脂提取

2.2.1 離子交換樹(shù)脂的選擇

絮凝液經(jīng)離子交換樹(shù)脂F(xiàn)PC3500、FPA51、FPA90CL、FPC22H靜態(tài)吸附后的顏色變化如表1 所示。

表1 靜態(tài)吸附后絮凝液的顏色變化Tab.1 Color of flocculation liquid after static adsorption

由表1 可知：絮凝液經(jīng)弱堿FPA51和強(qiáng)酸FPC22H樹(shù)脂吸附后幾乎無(wú)色，表明這2種樹(shù)脂均有較好的脫色效果；不同pH值的絮凝液經(jīng)弱酸FPC3500和強(qiáng)堿FPA90CL樹(shù)脂吸附后均具有一定顏色，表明這2種樹(shù)脂吸附色素能力較差，但是隨著絮凝液pH值變小，吸附后絮凝液的顏色變淺，表明較低的pH值有利于這2種樹(shù)脂吸附色素。

絮凝液經(jīng)離子交換樹(shù)脂F(xiàn)PC3500、FPA90CL、FPC22H、FPA51靜態(tài)吸附后的活性變化如表2 所示。

由表2 可知，強(qiáng)酸FPC22H和弱堿FPA51樹(shù)脂對(duì)絮凝液中活性物質(zhì)的吸附效果最好，F(xiàn)PA90CL樹(shù)脂越偏堿吸附效果越好。由于FPC22H樹(shù)脂在不同pH值下都可以完全吸附絮凝液中的活性物質(zhì)，因此，選擇FPC22H樹(shù)脂更為合適。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：吸附活性物質(zhì)的強(qiáng)酸FPC22H和弱堿FPA51樹(shù)脂的水、70%乙醇洗脫液均無(wú)活性，可能是洗脫液的濃度不合適，需進(jìn)一步探索。

表2 不同pH值的絮凝液被離子交換樹(shù)脂吸附后的抑菌圈直徑／cmTab.2 Inhibition zone diameter for different pH values of flocculation liquid after static adsorption by ion exchange resin／cm

2.2.2 離子交換樹(shù)脂提取條件的選擇

由前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，靜態(tài)條件下FPC22H可以完全吸附絮凝液中的活性物質(zhì)，故選擇FPC22H研究其動(dòng)態(tài)條件下對(duì)活性物質(zhì)的吸附與洗脫。

1）吸附

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：絮凝液經(jīng)FPC22H吸附后的流出液中前9管都沒(méi)有活性，只有第10管有活性（抑菌圈直徑為0.95cm，圖1）。說(shuō)明10.0g樹(shù)脂在吸附270.0 mL（因每30.0mL收集1管）絮凝液時(shí)達(dá)到飽和，此時(shí)應(yīng)停止吸附。后續(xù)實(shí)驗(yàn)絮凝液和樹(shù)脂比例以20mL∶1g較為合適。

圖1 絮凝液經(jīng)FPC22H樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附后第10管有活性Fig.1 Activity of 10th tube of flocculation liquid after dynamic adsorption by FPC22Hresin

由圖1可知，10號(hào)樣品有一定活性，11號(hào)樣品僅有微弱活性，可能為殘余在樹(shù)脂中未被吸附的部分活性物質(zhì)。

2）洗脫

以乙醇、氨水為洗脫劑，對(duì)吸附了活性物質(zhì)的FPC22H樹(shù)脂進(jìn)行洗脫，考察洗脫液的顏色變化及活性，結(jié)果如表3 、表4所示。

綜合表3 和表4可知：（1）乙醇可以脫去色素，但不能洗脫活性物質(zhì)，其中50%乙醇脫色效果最好，可能是因?yàn)樵摶钚晕镔|(zhì)的極性比乙醇大；（2）0.05mol·L－1的氨水和0.5mol·L－1的氨水都可以洗脫活性物質(zhì)，而且都有顏色，可能是該活性物質(zhì)本身有顏色或者是有一種或幾種同活性物質(zhì)性質(zhì)相同的色素被同時(shí)洗脫下來(lái)；（3）0.05mol·L－1氨水的洗脫效果最好，洗脫后的溶液活性比吸附前減弱，說(shuō)明活性物質(zhì)有部分損失。

表3 乙醇和氨水洗脫液的顏色變化Tab.3 Color of alcohol and ammonia eluention

表4 氨水洗脫液的抑菌圈直徑／cmTab.4 Inhibition zone diameter of ammonia eluention／cm

3 結(jié)論

研究了芽孢細(xì)菌Gracilibacillus ureilyticus抗白色念珠菌活性物質(zhì)的分離提取工藝，確定脫色及提取工藝如下：（1）絮凝液選用D101大孔吸附樹(shù)脂脫色，合適的絮凝液與D101樹(shù)脂比例為10mL∶1g，大孔吸附樹(shù)脂吸附的部分活性物質(zhì)可被水全部洗脫。（2）選擇強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂F(xiàn)PC22H吸附絮凝液，絮凝液中活性物質(zhì)可以被FPC22H樹(shù)脂吸附且不受pH值影響，合適的絮凝液與FPC22H樹(shù)脂比例為20mL∶1g；0.05mol·L－1氨水的洗脫效果最好。

[1]殷瑜，黃為一，陳代杰.微生物來(lái)源的抗真菌抗生素的研究進(jìn)展[J］.中國(guó)新藥雜志，2004，13（2）：113－117.

[2]劉自貴，裘雁秋，譚明珍，等.院內(nèi)真菌感染及其藥物的敏感性分析[J］.華西醫(yī)學(xué)，1999，14（4）：393－394.

[3]周中仲，孫殿春，鄭慧哲，等.新型抗真菌藥物尼可霉素的進(jìn)展[J］.中國(guó)制藥信息，2002，18（1）：22－25.

[4]高國(guó)平.兩性霉素B腎中毒[J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)：外科學(xué)分冊(cè)，1995，22（4）：218－219.

[5]HUO Y Y，XU X W，CUI H L，et al.Gracilibacillus ureilyticus sp.nov.，a halotolerant bacterium from a saline－alkaline soil[J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2010，60（6）：1383－1386.

[6]梁雪琴.一種核苷嘧啶類抗真菌抗生素的分離純化及抗菌活性的研究[D］.杭州：浙江大學(xué)，2010.