齊燕南,邢瑩瑩,奚 濤
(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京210009)
在基因組中,除了核酸序列本身,還有許多信息可以調(diào)控基因表達并且可以遺傳給子代,這就是表觀遺傳學(xué)[1]。表觀遺傳學(xué)主要包括DNA甲基化和組蛋白修飾。其中,組蛋白修飾在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。組蛋白修飾包括乙?;⒓谆?、磷酸化、核糖基化、瓜氨酸化、泛素化等6種形式[2]。
SMYD3是一種新發(fā)現(xiàn)的組蛋白甲基化酶,它包含SET和MYND兩個結(jié)構(gòu)域,通過與啟動子區(qū)域的“5′-CCCTCC-3′”序列結(jié)合可以上調(diào)下游基因(包括很多原癌基因[3])的表達,在腫瘤發(fā)生中有著重要的作用,但SMYD3需要進入細胞核才能發(fā)揮其組蛋白甲基化酶的作用。SMYD3的過表達可以促進多種癌細胞的增殖[4-5],而用 RNAi敲除SMYD3則可以明顯抑制癌細胞的增殖[6]。羅學(xué)剛等[7]研究表明,SMYD3過表達可以促進人乳腺癌細胞的增殖,而抑制組蛋白修飾將促進癌細胞的凋亡[8],說明抑制SMYD3通路有望成為腫瘤治療的新方法。
格爾德霉素(geldanamycin)是一種HSP90特異性的抑制劑。研究表明,HSP90可以與SMYD3形成復(fù)合體促進SMYD3在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控[4]。
作者在此研究了格爾德霉素對SMYD3核轉(zhuǎn)位的影響,并探討了SMYD3核轉(zhuǎn)位受到抑制時對細胞增殖的影響。
人乳腺癌細胞株MDA-MB-231,中國藥科大學(xué)腫瘤藥理實驗室。
1640、胎牛血清,Gibco公司;胰酶;PBS;二甲基亞砜(DMSO);MTT;核蛋白提取試劑盒,南京凱基;SMYD3多克隆抗體,自制;β-actin多克隆抗體,Santa Cruz公司;脫脂奶粉;蛋白印記發(fā)光液,Pierce公司;顯影液;定影液;格爾德霉素,上海生工。
RPMI 1640培養(yǎng)基:含10%的胎牛血清、100μg·mL-1的鏈霉素和100U·mL-1的青霉素。
細胞培養(yǎng)箱,ThermoForma公司;酶標儀,BioRad公司;倒置顯微鏡,Leica公司;6孔板、96孔板,Corning公司。
1.2.1 Western blot法檢測SMYD3核轉(zhuǎn)位
將 MDA-MB-231細胞(在 RPMI 1640培養(yǎng)基中于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng))接種于6孔板中培養(yǎng)至70%融合。將格爾德霉素溶于DMSO,加至6孔板中,使每孔的格爾德霉素終濃度(μmol·L-1)分別為0.03、0.06、0.12、0.24、0.48,繼續(xù)培養(yǎng)24h。將細胞用胰酶消化,離心,PBS洗2遍,按照核蛋白提取試劑盒說明提取核蛋白和胞質(zhì)蛋白。蛋白濃度用BCA法測定。
取蛋白樣品50μg進行電泳(SDS-PAGE):分離膠為10%,濃縮膠為5%,起始電壓為80V,電泳至分離膠時調(diào)為120V,繼續(xù)電泳2h。電泳完成后半干式轉(zhuǎn)移到NC膜上。一抗4℃過夜孵育,二抗室溫1h孵育,用ECL發(fā)光液暗室顯色,考察格爾德霉素對SMYD3核轉(zhuǎn)位的影響。
1.2.2 MTT比色法檢測 MDA-MB-231細胞的增殖
將MDA-MB-231細胞以每孔5×103個接種于96孔板,培養(yǎng)至70%融合,加入不同濃度(0.03、0.06、0.12、0.24、0.48,μmol·L-1)格爾德霉素繼續(xù)培養(yǎng)24h,向待測每孔加入20μL濃度為5mg·mL-1的MTT,37℃繼續(xù)孵育4h,加入150μL的DMSO,用酶標儀在波長570nm處測定吸光度(吸光度與細胞存活數(shù)成正比),考察格爾德霉素對 MDA-MB-231細胞增殖的影響。
經(jīng)過24h不同濃度格爾德霉素處理后,提取MDA-MB-231細胞的核蛋白和胞質(zhì)蛋白,采用 Western blot法檢測SMYD3的入核情況,結(jié)果見圖1。
由圖1可見,隨著格爾德霉素濃度的增大,入核的SMYD3逐漸減少,說明格爾德霉素能濃度依賴性地抑制SMYD3的入核。
由圖2可知,格爾德霉素具有較好的抗腫瘤能力,濃度為0.03mol·L-1時就對 MDA-MB-231細胞增殖有明顯的抑制作用。表明格爾德霉素可以通過抑制SMYD3的核轉(zhuǎn)位抑制MDA-MB-231細胞的增殖。
圖2 格爾德霉素對MDA-MB-231細胞增殖的影響Fig.2 Effect of geldanamycin on the proliferation of cancer cells MDA-MB-231
采用Western blot檢測法研究了不同濃度的格爾德霉素對人乳腺癌細胞 MDA-MB-231中SET 和MYND結(jié)構(gòu)域蛋白3(SMYD3)核轉(zhuǎn)位的影響,采用MTT比色法檢測了格爾德霉素對人乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的影響。結(jié)果表明:格爾德霉素可以抑制SMYD3的核轉(zhuǎn)位,并且這種抑制作用是濃度依賴性的;與對照組相比,人乳腺癌細胞 MDA-MB-231的增殖速率被顯著地抑制了。說明格爾德霉素可以通過抑制SMYD3的核轉(zhuǎn)位顯著抑制人乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖。
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