李艷艷　畢玉　張偉

【摘要】 目的：通過(guò)對(duì)人類(lèi)FOXL2基因突變譜研究，確定FOXL2基因突變分型及其與小瞼裂綜合征的相關(guān)性。方法：收集所有的突變，并對(duì)這些突變進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理并分類(lèi)，進(jìn)行蛋白表達(dá)譜分析，各功能區(qū)分析以及患者的臨床特征與突變相關(guān)性分析。結(jié)果：根據(jù)分析，將FOXL2基因突變分為10型，各分型與小瞼裂綜合征患者的臨床特征關(guān)系各不相同。單純性卵巢功能早衰患者及單純性上瞼下垂患者與FOXL2基因突變無(wú)密切相關(guān)性。結(jié)論：FOXL2的突變與BPES發(fā)病密切相關(guān)，多聚丙氨酸區(qū)域的喪失與Ⅰ型BPES密切相關(guān)。FOXL2的突變與單純性POF及上瞼下垂的發(fā)病關(guān)系并不密切。

【關(guān)鍵詞】 小瞼裂綜合征； FOXL2； 卵巢功能早衰； 突變

FOXL2基因是一個(gè)2.7 kb的單外顯子基因，編碼376個(gè)氨基酸，預(yù)期的蛋白質(zhì)屬于翼狀螺旋/叉頭型轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)家族，包含一個(gè)特有的101個(gè)氨基酸的forkhead DNA結(jié)構(gòu)域和一個(gè)與此分離但功能尚未闡明的多聚丙氨酸肽段。小瞼裂綜合征（BPES）是表現(xiàn)為瞼裂狹小、上瞼下垂和倒轉(zhuǎn)型內(nèi)眥贅皮等一系列癥狀的常染色體顯性遺傳病。臨床上分為兩型：Ⅰ型：女性患者不育，原發(fā)閉經(jīng)或提前絕經(jīng)、小子宮和卵巢功能早衰；Ⅱ型：男女患者均可生育。目前研究證實(shí)FOXL2基因與BPES的發(fā)病密切相關(guān)，是首選致病基因。

1 材料與方法

1.1 材料 參考The human FOXL2 mutation database（http：//medgen.ugent.be/foxl2/）[1]，搜集所有報(bào)道過(guò)的突變，共發(fā)現(xiàn)有144個(gè)變異位點(diǎn)，其中包括15個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)。對(duì)這些突變進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理并分類(lèi)，同時(shí)進(jìn)行蛋白表達(dá)譜分析，各功能區(qū)分析，以及患者的臨床特征與突變相關(guān)性分析。

1.2 突變位點(diǎn)的研究方法 （1）直接測(cè)序；（2）多重性連接依賴(lài)的探針擴(kuò)增法；（3）微衛(wèi)星位點(diǎn)分析和單核苷酸多態(tài)性分析；（4）熒光原位雜交技術(shù)分析。

1.3 前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析 筆者對(duì)一期收集到的29例BPES患者血樣進(jìn)行FOXL2基因突變研究，并將前期實(shí)驗(yàn)中所得的突變結(jié)果進(jìn)行分析歸類(lèi)[2-3]。

2 結(jié)果

2.1 FOXL2的功能區(qū) FOXL2的功能區(qū)包括forkhead DNA結(jié)合域（第52～152殘基區(qū)域）、功能尚未闡明的多聚丙氨酸肽段（221～234位氨基酸殘基區(qū)）以及轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（第280～320殘基區(qū)域）。

2.2 分類(lèi)結(jié)果 突變譜共分10型，具體分型如下：A：蛋白截短，無(wú)forkhead DNA結(jié)合域及其后的所有氨基酸；B：蛋白截短，包含部分forkhead DNA結(jié)合域；C：蛋白截短，包含完整forkhead DNA結(jié)合域，無(wú)多聚丙氨酸肽段及轉(zhuǎn)錄激活區(qū)；D：蛋白截短，包含完整forkhead DNA結(jié)合域和完整的多聚丙氨酸肽段，無(wú)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)；E：轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域突變，蛋白截短或延長(zhǎng)，包含完整forkhead DNA結(jié)合域和完整的多聚丙氨酸肽段；F：轉(zhuǎn)錄激活區(qū)后的突變，蛋白截短或延長(zhǎng)，包含完整forkhead DNA結(jié)合域、多聚丙氨酸肽段及轉(zhuǎn)錄激活區(qū)；G：多聚丙氨酸肽段框架內(nèi)移碼突變，蛋白延長(zhǎng)或截短；H：只有錯(cuò)義突變，單個(gè)堿基的替換或顛換；I：包括微缺失及FOXL2基因與其他基因的染色體重排；J：其他突變，包括5′-UTR和3′-UTR區(qū)域變異。

2.3 患者的臨床特征與突變相關(guān)性分析結(jié)果 所有發(fā)現(xiàn)突變的患者均為典型的BPES，兩型BPES存在著基因型和表現(xiàn)型的相互關(guān)聯(lián)。同一個(gè)突變可導(dǎo)致明顯的家系內(nèi)和家系間的表型多樣性，即表現(xiàn)型和基因型的多樣性。

A組突變由于forkhead區(qū)域的破壞致DNA結(jié)合能力的下降，從而導(dǎo)致FOXL2的單型缺陷；由于缺乏相關(guān)的信息，對(duì)B組不能作出相關(guān)性判斷；C組，蛋白截短，無(wú)多聚丙氨酸肽段及多聚脯氨酸肽段，發(fā)生POF幾率非常高，多為BPESⅠ型；D組，具有完整的forkhead和聚丙氨酸區(qū)域，蛋白截短，家系內(nèi)存在表現(xiàn)型的多樣性；E組，具有完整的forkhead和聚丙氨酸區(qū)域，移碼突變導(dǎo)致蛋白延長(zhǎng)，導(dǎo)致Ⅰ型和Ⅱ型BPES；F組的基因型與表現(xiàn)型亦不能作出相關(guān)性判斷；G組的多聚丙氨酸肽段突變框架移碼突變，導(dǎo)致聚丙氨酸擴(kuò)增，發(fā)生在Ⅱ型BPES家系和類(lèi)型不明確的家系中。多聚丙氨酸肽段延長(zhǎng)，導(dǎo)致聚丙氨酸擴(kuò)增，多發(fā)生在Ⅱ型BPES家系；H組錯(cuò)義突變，由于病例數(shù)量少及缺乏相關(guān)的信息，不能作出判斷；I組發(fā)生在散發(fā)的患者和家族性BPES，多伴發(fā)智力低下；J組未引起任何蛋白變異，由于病例數(shù)量少及缺乏相關(guān)的信息，不能作出相關(guān)性判斷。

單純的卵巢功能早衰（POF）患者中發(fā)現(xiàn)的FOXL2的變異均為單核苷酸多態(tài)性（SNP），筆者對(duì)30例單純性上瞼下垂患者的FOXL2基因進(jìn)行突變分析時(shí)未發(fā)現(xiàn)此基因的突變。

2.4 前期實(shí)驗(yàn)中的突變的分析及歸類(lèi) 筆者對(duì)一期收集到的29例BPES患者及100例眼瞼發(fā)育正常的人的血樣提取FOXL2基因進(jìn)行突變研究，發(fā)現(xiàn)的3個(gè)突變位點(diǎn)分別為892C>T、951～953delC及901～930dup30。

892C>T為無(wú)義突變，蛋白截短，包含完整forkhead DNA結(jié)合域，但無(wú)多聚丙氨酸肽段及多聚脯氨酸肽段，屬于C組；951～953delC為缺失突變后引起移碼突變，蛋白截短，包含完整forkhead DNA結(jié)合域和多聚丙氨酸肽段，無(wú)多聚脯氨酸肽段，屬于D組；901～930dup30為重復(fù)突變，多聚丙氨酸肽段框架內(nèi)移位突變，蛋白延長(zhǎng)，屬于G組。

另外，據(jù)報(bào)道的中國(guó)人BPES患者中FOXL2基因的突變共有24種，除去筆者報(bào)道的3種[2-3]，其余21種分組情況如下：475dupC屬于B組；704delG及804dupC屬于D組；1091 delC屬于E組；1041～1042 insC屬于F組；909～938 dup30及933～965dup33屬于G組；H組突變比較多，分別為425 T>C；773C>G；655C>T；370 A>G；340A>G；384G>A；241T>C；650C>G；50C→TA及2293-2294insT屬于J組；其中672～701dup30；663～692dup30以及858～874dup17不屬于以上突變分型的任何分組，提示在這些突變區(qū)域可能存在其他功能部位[4-13]。endprint

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)分為3類(lèi)：酸性激活區(qū)、谷氨酰胺富含區(qū)和脯氨酸富含區(qū)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)FOXL2功能區(qū)的研究只提出其forkhead DNA結(jié)合區(qū)和一個(gè)與此分離的多聚丙氨酸區(qū)域，并未提及轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。通過(guò)對(duì)FOXL2功能域的分析，未發(fā)現(xiàn)明顯的酸性區(qū)及谷氨酰胺富含區(qū)，只有一個(gè)脯氨酸富含區(qū)，即280～320區(qū)域，此區(qū)內(nèi)脯氨酸含量高達(dá)45%，因此，筆者認(rèn)為此區(qū)為FOXL2的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。另外，突變譜的結(jié)果亦顯示此區(qū)域?yàn)橥蛔兏甙l(fā)區(qū)，認(rèn)為是由于轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的突變使轉(zhuǎn)錄因子失去轉(zhuǎn)錄功能而導(dǎo)致其作用蛋白的功能異常，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

突變類(lèi)型的分組與De Baere等[14]的分組略有不同，筆者主要是根據(jù)FOXL2功能區(qū)進(jìn)行突變類(lèi)型的分組，如此可以更好的了解FOXL2突變與功能的關(guān)系，從而為明確FOXL2的確切致病機(jī)理提供依據(jù)。De Baere等[14]在對(duì)多例BPES家系研究后提出由同一個(gè)突變可導(dǎo)致明顯的家系內(nèi)和家系間的表型多樣性，即表現(xiàn)型和基因型的多樣性，筆者認(rèn)為主要是由于基因背景不同和基因的相互作用造成的。

FOXL2控制瞼裂發(fā)育的目標(biāo)基因尚不清楚。據(jù)推測(cè)，F(xiàn)OXL2很可能是控制某些基因，如TGF-α、EGFr、Inhbb、控制睜眼及瞼裂的基因位點(diǎn)，而這些基因與其他與眼前節(jié)發(fā)育有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子共同影響瞼裂的發(fā)育，如Pax6、Bmp4、Bmp7等[15-16]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXL2的一個(gè)同源基因FOXO對(duì)某些調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的抗凋亡或促凋亡基因有調(diào)節(jié)作用。FOXL2可能參與了對(duì)胚胎早期眼瞼及眼周肌肉發(fā)育過(guò)程中某些調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的抗凋亡或促凋亡基因的調(diào)節(jié)，其具體的作用機(jī)制，還有待于進(jìn)一步地研究證實(shí)。

綜上所述，F(xiàn)OXL2的突變與BPES發(fā)病密切相關(guān)，任何區(qū)域的突變都可以導(dǎo)致其功能異常，從而導(dǎo)致BPES。多聚丙氨酸區(qū)域的喪失與Ⅰ型BPES密切相關(guān)。FOXL2的突變與單純性POF及上瞼下垂的發(fā)病關(guān)系并不密切。

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（收稿日期：2014-06-12） （本文編輯：蔡元元）endprint

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