李平　楊凱　劉強等

【摘要】 目的：觀察兔激素性股骨頭缺血壞死體外沖擊波療法（ESWT）干預后，血漿中血小板α-顆粒膜蛋白（GMP-140）、血栓調節(jié)蛋白（TM）及骨保護素（OPG）的表達。方法：選取健康成年雄性日本大耳兔50只，激素造模后隨機處死2只驗證造模成功，其余按隨機數(shù)字表法分為模型對照組（A組）24只和沖擊波治療組（B組）24只。干預前，兩組隨機選取8只兔耳動脈采血測血漿GMP-140、TM、OPG含量；ESWT干預第2、4、8周時A、B組各隨機選取8只兔，耳動脈采血后處死，測血漿GMP-140、TM、OPG含量；留取股骨頭標本行HE染色觀察大體病理變化，免疫組化觀察股骨頭中OPG陽性表達，并進行半定量分析。結果：ESWT干預2、4、8周后，B組血漿中的GMP-140、TM含量較A組均降低（P<0.05）；ESWT干預4周、8周時B組血漿中OPG含量較A組均升高（P<0.05）。ESWT干預2、4、8周時B組股骨頭中的OPG陽性表達較A組均升高（P<0.05）。結論：兔激素性股骨頭壞死ESWT干預可使血漿中OPG含量增高，GMP-140、TM含量降低，局部壞死區(qū)OPG表達增強。

【關鍵詞】 股骨頭壞死； 體外沖擊波； 骨保護素； 血小板α-顆粒膜蛋白； 血栓調節(jié)蛋白

激素性股骨頭缺血壞死（Steroid induced Avascular Necrosis of Femoral Head，SANFH）居非創(chuàng)傷性股骨頭缺血壞死諸多病因首位，盡管人工關節(jié)置換效果滿意，但對于年輕或不能行手術的患者，治療上仍是骨科的難題。體外沖擊波治療（Extracorporeal Shock Wave Therapy，ESWT）經證實對股骨頭缺血壞死有效，但其治療機制仍不十分清楚[1]。本文旨在觀察體外沖擊波對GMP-140、TM、OPG表達的影響，探討體外沖擊波療法的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年日本大耳兔50只，體重2.5～3.5 kg，雄性（由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供），顆粒飼料分籠喂養(yǎng)。大腸桿菌脂多糖（LPS，Sigma公司）；甲潑尼龍琥珀酸鈉（MP，輝瑞公司）；OPG分析試劑盒（上海藍基生物科技有限公司）；OPG兔抗鼠多克隆抗體（北京中山生物技術公司），GMP-140試劑盒（上海太陽生物技術公司），TM試劑盒（American Diagostica公司），SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；沖擊波骨科治療機（深圳慧康醫(yī)療器械有限公司，HK.ESWOAJII型）。

1.2 造模及分組 健康成年雄性日本大耳兔50只，造模方法采用Yamamoto法[2]，于兔耳緣靜脈注射LPS（10 μg/kg），24 h后重復給藥1次；在第2次注射大腸桿菌內毒素后，立即臀肌注射甲潑尼龍琥珀酸鈉（40 mg/kg），共3次，每次間隔24 h（每次給藥前均測量體重，調整劑量）；注射激素期間青霉素20萬單位/kg臀肌注射，預防感染。造模完成后隨機選取2只兔予以空氣栓塞法處死，留取股骨頭，10%甲醛固定，脫鈣液進行脫鈣，脫鈣滿意后縱行剖開，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察股骨頭見：部分骨小梁變細，空骨陷窩較多，骨小梁內脂滴較多，證明股骨頭有壞死，造模成功。將造模后的動物按隨機數(shù)字表法分為模型對照組（A組）和沖擊波治療組（B組），每組24只，各組動物相同條件喂養(yǎng)。

1.3 ESWT干預 B組麻醉后，股骨頭區(qū)剃毛、涂抹耦合劑，X線透視定位確定沖擊波焦點，電壓10.5 kV，頻率70次/min，15 min/次，1次/d，共5次，給予沖擊波干預。

1.4 標本采集與檢測 ESWT干預前各組隨機選取8只兔耳動脈采血2～4 mL，緩慢加入含有200 μL 20%EDTA-Na2的試管中，離心處理（3000 r/min，離心10 min），取上層血漿，置于-80 ℃冰箱保存；ESWT干預2、4、8周時分別于各組隨機抽取8只兔，耳動脈采血2～4 mL后依前法處理后保存；空氣栓塞法處死兔，留取股骨頭，10%甲醛固定，脫鈣液進行脫鈣，脫鈣滿意后縱行剖開，石蠟包埋，切片，HE染色鏡下觀察股骨頭病理變化；切片常規(guī)脫蠟、脫水后，SABC法免疫組織化學染色。以已知陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照，嚴格按說明書操作。光鏡下免疫陽性細胞胞漿呈棕黃色，每個股骨頭標本相同部位各切片2張，每張切片在高倍鏡（400倍）下隨機選取5個非重疊視野，采用BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，計算每個視野中陽性染色面積占總視野面積的百分比并求其平均值。血漿中GMP-140、TM、OPG測量嚴格按照試劑盒說明操作。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據進行處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用重復測量方差分析，組間均數(shù)間比較用LSD-t檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 股骨頭組織形態(tài)學變化 大體標本：造模完成后股骨頭縱剖面有含鐵血黃素沉著，軟骨下可見囊性變；A組股骨頭在各個觀察時間點與造模完成時無明顯變化；ESWT干預2周時B組股骨頭軟骨下囊性變較干預前減輕；ESWT干預4周時B組股骨頭表面光滑、軟骨下病變較前減輕；干預8周后B組股骨頭軟骨面平滑，軟骨下病變不明顯。

2.2 兩組HE染色變化 A組鏡下可見骨小梁稀疏、斷裂，成骨細胞核固縮，骨細胞空骨陷窩>50%，且隨著實驗時間的推移，鏡下所見基本相同。ESWT干預2周時B組可見散在的骨髓細胞結構模糊、淡染的粉紅色區(qū)域及空骨陷窩；干預4周時B組成骨細胞清晰可見，空骨陷窩較2周前減少；干預8周時鏡下可見B組空骨陷窩很少見，骨小梁排布趨于正常。

2.3 兩組血漿中GMP-140、TM、OPG含量變化 ESWT干預2、4、8周后，B組血漿中GMP-140、TM含量較A組均降低（P<0.05）。ESWT干預2周后兩組血漿中OPG含量變化不明顯（P>0.05）；4、8周時B組血漿中OPG含量較A組均升高（P<0.05）endprint

2.4 兩組股骨頭中OPG陽性表達 ESWT干預2、4、8周時A組股骨頭中OPG表達均低于B組同時間點（P<0.05）。

3 討論

股骨頭缺血壞死多發(fā)于30～59歲的中青年，激素所致的股骨頭壞死是最常見原因之一[3]。其發(fā)病機制多與激素導致的脂代謝紊亂、血管內皮細胞損傷及骨質疏松等有關，而脂質代謝紊亂、高凝低纖溶狀態(tài)正是股骨頭缺血壞死的病理生理學基礎[4-7]。

3.1 GMP-140、TM和OPG的生物學特性 GMP-140主要分布在α-顆粒膜上，在血小板活化后，α-顆粒可迅速與血小板膜融合并釋放，使GMP-140重新分布于血小板表面，故GMP-140在血小板表面的表達是血小板活化的特異性標志物之一[8]。有文獻[9]報道，GMP-140較β-血栓球蛋白等其他指標更能準確反映體內血小板的活化狀態(tài)。也有文獻[10]報道，血小板表面GMP-140表達明顯增高和HDL-膽固醇呈負相關，與前β脂蛋白呈正相關，說明血小板激活可能依賴于脂代謝紊亂。

血栓調節(jié)蛋白（Thrombomodulin，TM）是一種膜糖蛋白，主要由血管內皮細胞合成，是一種重要的內皮保護因子和抗凝分子，正常生理情況下血管內皮細胞不分泌和釋放TM，只有出現(xiàn)血管內皮細胞損傷時，TM降解段會釋放入血。故TM可作為血管內皮損傷和破壞的一個標志[11]。有文獻[12]也表明，股骨頭壞死前后TM有明顯變化，說明在股骨頭壞死過程中存在血管內皮細胞損傷。

OPG是一種新的腫瘤壞死因子，在體內多器官中都有較高水平的表達。骨骼中的OPG主要由成骨細胞譜系的各種細胞產生，隨細胞的分化而增加。OPG能促進成骨細胞樣細胞分化為成熟的成骨細胞，激發(fā)成骨細胞的成骨活性。同時又可抑制成熟破骨細胞的骨吸收活性并誘導其凋亡[13]。體外實驗也證實，OPG抑制破骨細胞前體細胞的分化以及成熟破骨細胞形成骨吸收陷窩，并誘導破骨細胞凋亡[14]。有研究報道，OPG還可通過減少內皮細胞凋亡從而對其起到保護作用，而激素可抑制OPG mRNA的表達，使OPG表達下調，加重細胞內皮損傷，導致微血管血栓形成[15]。

3.2 ESWT的作用 激素性股骨頭缺血壞死的病變是因脂代謝紊亂使血管內皮細胞損傷，血流淤滯緩慢，誘發(fā)血小板聚集，易形成血栓。同時脂肪代謝紊亂致股骨頭內脂肪占位擠壓微血管，加劇血管栓塞和血栓形成，最終使股骨頭內血管栓塞，骨細胞缺血壞死而致骨丟失，表現(xiàn)為軟骨下骨囊性變，股骨頭塌陷[4]。ESWT經臨床證實可治療股骨頭缺血壞死，其作用機制可能是通過影響機體生物學環(huán)境和細胞因子的調節(jié)而發(fā)揮作用。有學者的研究發(fā)現(xiàn)，體外沖擊波治療后骨壞死區(qū)出現(xiàn)明顯的成骨過程，且伴有血管內皮生長因子表達增多[16-17]。Takahashi等[18]也發(fā)現(xiàn)，體外沖擊波可促使成骨細胞表達細胞外基質蛋白相關基因從而促進成骨。王大偉等[19]研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可干預股骨頭缺血性壞死兔骨保護骨素基囚的表達，從而起到治療作用。

本實驗通過對兔進行激素造模，觀察到A組各個時間點股骨頭壞死局部OPG表達較B組均低，且隨著時間推移逐漸降低，并逐漸出現(xiàn)成骨細胞核固縮、空骨陷窩增加等典型的激素性股骨頭壞死病變。而B股骨頭局部OPG表達均較A組增強，也未出現(xiàn)典型骨壞死病理改變，說明ESWT對股骨頭缺血壞死的過程有干預作用，可能是ESWT干預了激素對OPG轉錄及表達的抑制作用，或是直接促進OPG的轉錄和表達，從而阻斷兔激素性股骨頭壞死骨丟失這一過程。在ESWT干預第2周時B組GMP-140、TM均較A組降低，OPG含量B組較A組無明顯變化；第4周及8周時B組GMP-140、TM均較A組降低，OPG含量較A組高，可能是ESWT對GMP-140、TM表達直接的抑制作用或是通過其他途徑間接致其表達降低，ESWT對局部OPG表達有優(yōu)先促進作用或是通過直接促進局部OPG表達進而使血漿中OPG含量增高。

綜上所述，ESWT可干預兔激素性股骨頭缺血壞死的病變過程，本實驗結果顯示對實驗動物血漿中的GMP-140、TM、OPG的表達有影響，但究竟是直接作用還是間接干預仍不十分清楚，還有待進一步研究。

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（收稿日期：2014-05-28） （本文編輯：蔡元元）endprint

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