李平　楊凱　劉強(qiáng)等

【摘要】 目的：觀察兔激素性股骨頭缺血壞死體外沖擊波療法（ESWT）干預(yù)后，血漿中血小板α-顆粒膜蛋白（GMP-140）、血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）及骨保護(hù)素（OPG）的表達(dá)。方法：選取健康成年雄性日本大耳兔50只，激素造模后隨機(jī)處死2只驗(yàn)證造模成功，其余按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組（A組）24只和沖擊波治療組（B組）24只。干預(yù)前，兩組隨機(jī)選取8只兔耳動(dòng)脈采血測(cè)血漿GMP-140、TM、OPG含量；ESWT干預(yù)第2、4、8周時(shí)A、B組各隨機(jī)選取8只兔，耳動(dòng)脈采血后處死，測(cè)血漿GMP-140、TM、OPG含量；留取股骨頭標(biāo)本行HE染色觀察大體病理變化，免疫組化觀察股骨頭中OPG陽(yáng)性表達(dá)，并進(jìn)行半定量分析。結(jié)果：ESWT干預(yù)2、4、8周后，B組血漿中的GMP-140、TM含量較A組均降低（P<0.05）；ESWT干預(yù)4周、8周時(shí)B組血漿中OPG含量較A組均升高（P<0.05）。ESWT干預(yù)2、4、8周時(shí)B組股骨頭中的OPG陽(yáng)性表達(dá)較A組均升高（P<0.05）。結(jié)論：兔激素性股骨頭壞死ESWT干預(yù)可使血漿中OPG含量增高，GMP-140、TM含量降低，局部壞死區(qū)OPG表達(dá)增強(qiáng)。

【關(guān)鍵詞】 股骨頭壞死； 體外沖擊波； 骨保護(hù)素； 血小板α-顆粒膜蛋白； 血栓調(diào)節(jié)蛋白

激素性股骨頭缺血壞死（Steroid induced Avascular Necrosis of Femoral Head，SANFH）居非創(chuàng)傷性股骨頭缺血壞死諸多病因首位，盡管人工關(guān)節(jié)置換效果滿意，但對(duì)于年輕或不能行手術(shù)的患者，治療上仍是骨科的難題。體外沖擊波治療（Extracorporeal Shock Wave Therapy，ESWT）經(jīng)證實(shí)對(duì)股骨頭缺血壞死有效，但其治療機(jī)制仍不十分清楚[1]。本文旨在觀察體外沖擊波對(duì)GMP-140、TM、OPG表達(dá)的影響，探討體外沖擊波療法的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年日本大耳兔50只，體重2.5～3.5 kg，雄性（由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），顆粒飼料分籠喂養(yǎng)。大腸桿菌脂多糖（LPS，Sigma公司）；甲潑尼龍琥珀酸鈉（MP，輝瑞公司）；OPG分析試劑盒（上海藍(lán)基生物科技有限公司）；OPG兔抗鼠多克隆抗體（北京中山生物技術(shù)公司），GMP-140試劑盒（上海太陽(yáng)生物技術(shù)公司），TM試劑盒（American Diagostica公司），SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；沖擊波骨科治療機(jī)（深圳慧康醫(yī)療器械有限公司，HK.ESWOAJII型）。

1.2 造模及分組 健康成年雄性日本大耳兔50只，造模方法采用Yamamoto法[2]，于兔耳緣靜脈注射LPS（10 μg/kg），24 h后重復(fù)給藥1次；在第2次注射大腸桿菌內(nèi)毒素后，立即臀肌注射甲潑尼龍琥珀酸鈉（40 mg/kg），共3次，每次間隔24 h（每次給藥前均測(cè)量體重，調(diào)整劑量）；注射激素期間青霉素20萬(wàn)單位/kg臀肌注射，預(yù)防感染。造模完成后隨機(jī)選取2只兔予以空氣栓塞法處死，留取股骨頭，10%甲醛固定，脫鈣液進(jìn)行脫鈣，脫鈣滿意后縱行剖開(kāi)，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察股骨頭見(jiàn)：部分骨小梁變細(xì)，空骨陷窩較多，骨小梁內(nèi)脂滴較多，證明股骨頭有壞死，造模成功。將造模后的動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組（A組）和沖擊波治療組（B組），每組24只，各組動(dòng)物相同條件喂養(yǎng)。

1.3 ESWT干預(yù) B組麻醉后，股骨頭區(qū)剃毛、涂抹耦合劑，X線透視定位確定沖擊波焦點(diǎn)，電壓10.5 kV，頻率70次/min，15 min/次，1次/d，共5次，給予沖擊波干預(yù)。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) ESWT干預(yù)前各組隨機(jī)選取8只兔耳動(dòng)脈采血2～4 mL，緩慢加入含有200 μL 20%EDTA-Na2的試管中，離心處理（3000 r/min，離心10 min），取上層血漿，置于-80 ℃冰箱保存；ESWT干預(yù)2、4、8周時(shí)分別于各組隨機(jī)抽取8只兔，耳動(dòng)脈采血2～4 mL后依前法處理后保存；空氣栓塞法處死兔，留取股骨頭，10%甲醛固定，脫鈣液進(jìn)行脫鈣，脫鈣滿意后縱行剖開(kāi)，石蠟包埋，切片，HE染色鏡下觀察股骨頭病理變化；切片常規(guī)脫蠟、脫水后，SABC法免疫組織化學(xué)染色。以已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗為陰性對(duì)照，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。光鏡下免疫陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈棕黃色，每個(gè)股骨頭標(biāo)本相同部位各切片2張，每張切片在高倍鏡（400倍）下隨機(jī)選取5個(gè)非重疊視野，采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算每個(gè)視野中陽(yáng)性染色面積占總視野面積的百分比并求其平均值。血漿中GMP-140、TM、OPG測(cè)量嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，組間均數(shù)間比較用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 股骨頭組織形態(tài)學(xué)變化 大體標(biāo)本：造模完成后股骨頭縱剖面有含鐵血黃素沉著，軟骨下可見(jiàn)囊性變；A組股骨頭在各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)與造模完成時(shí)無(wú)明顯變化；ESWT干預(yù)2周時(shí)B組股骨頭軟骨下囊性變較干預(yù)前減輕；ESWT干預(yù)4周時(shí)B組股骨頭表面光滑、軟骨下病變較前減輕；干預(yù)8周后B組股骨頭軟骨面平滑，軟骨下病變不明顯。

2.2 兩組HE染色變化 A組鏡下可見(jiàn)骨小梁稀疏、斷裂，成骨細(xì)胞核固縮，骨細(xì)胞空骨陷窩>50%，且隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的推移，鏡下所見(jiàn)基本相同。ESWT干預(yù)2周時(shí)B組可見(jiàn)散在的骨髓細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊、淡染的粉紅色區(qū)域及空骨陷窩；干預(yù)4周時(shí)B組成骨細(xì)胞清晰可見(jiàn)，空骨陷窩較2周前減少；干預(yù)8周時(shí)鏡下可見(jiàn)B組空骨陷窩很少見(jiàn)，骨小梁排布趨于正常。

2.3 兩組血漿中GMP-140、TM、OPG含量變化 ESWT干預(yù)2、4、8周后，B組血漿中GMP-140、TM含量較A組均降低（P<0.05）。ESWT干預(yù)2周后兩組血漿中OPG含量變化不明顯（P>0.05）；4、8周時(shí)B組血漿中OPG含量較A組均升高（P<0.05）endprint

2.4 兩組股骨頭中OPG陽(yáng)性表達(dá) ESWT干預(yù)2、4、8周時(shí)A組股骨頭中OPG表達(dá)均低于B組同時(shí)間點(diǎn)（P<0.05）。

3 討論

股骨頭缺血壞死多發(fā)于30～59歲的中青年，激素所致的股骨頭壞死是最常見(jiàn)原因之一[3]。其發(fā)病機(jī)制多與激素導(dǎo)致的脂代謝紊亂、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及骨質(zhì)疏松等有關(guān)，而脂質(zhì)代謝紊亂、高凝低纖溶狀態(tài)正是股骨頭缺血壞死的病理生理學(xué)基礎(chǔ)[4-7]。

3.1 GMP-140、TM和OPG的生物學(xué)特性 GMP-140主要分布在α-顆粒膜上，在血小板活化后，α-顆?？裳杆倥c血小板膜融合并釋放，使GMP-140重新分布于血小板表面，故GMP-140在血小板表面的表達(dá)是血小板活化的特異性標(biāo)志物之一[8]。有文獻(xiàn)[9]報(bào)道，GMP-140較β-血栓球蛋白等其他指標(biāo)更能準(zhǔn)確反映體內(nèi)血小板的活化狀態(tài)。也有文獻(xiàn)[10]報(bào)道，血小板表面GMP-140表達(dá)明顯增高和HDL-膽固醇呈負(fù)相關(guān)，與前β脂蛋白呈正相關(guān)，說(shuō)明血小板激活可能依賴于脂代謝紊亂。

血栓調(diào)節(jié)蛋白（Thrombomodulin，TM）是一種膜糖蛋白，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，是一種重要的內(nèi)皮保護(hù)因子和抗凝分子，正常生理情況下血管內(nèi)皮細(xì)胞不分泌和釋放TM，只有出現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)，TM降解段會(huì)釋放入血。故TM可作為血管內(nèi)皮損傷和破壞的一個(gè)標(biāo)志[11]。有文獻(xiàn)[12]也表明，股骨頭壞死前后TM有明顯變化，說(shuō)明在股骨頭壞死過(guò)程中存在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

OPG是一種新的腫瘤壞死因子，在體內(nèi)多器官中都有較高水平的表達(dá)。骨骼中的OPG主要由成骨細(xì)胞譜系的各種細(xì)胞產(chǎn)生，隨細(xì)胞的分化而增加。OPG能促進(jìn)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞分化為成熟的成骨細(xì)胞，激發(fā)成骨細(xì)胞的成骨活性。同時(shí)又可抑制成熟破骨細(xì)胞的骨吸收活性并誘導(dǎo)其凋亡[13]。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，OPG抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化以及成熟破骨細(xì)胞形成骨吸收陷窩，并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡[14]。有研究報(bào)道，OPG還可通過(guò)減少內(nèi)皮細(xì)胞凋亡從而對(duì)其起到保護(hù)作用，而激素可抑制OPG mRNA的表達(dá)，使OPG表達(dá)下調(diào)，加重細(xì)胞內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致微血管血栓形成[15]。

3.2 ESWT的作用 激素性股骨頭缺血壞死的病變是因脂代謝紊亂使血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血流淤滯緩慢，誘發(fā)血小板聚集，易形成血栓。同時(shí)脂肪代謝紊亂致股骨頭內(nèi)脂肪占位擠壓微血管，加劇血管栓塞和血栓形成，最終使股骨頭內(nèi)血管栓塞，骨細(xì)胞缺血壞死而致骨丟失，表現(xiàn)為軟骨下骨囊性變，股骨頭塌陷[4]。ESWT經(jīng)臨床證實(shí)可治療股骨頭缺血壞死，其作用機(jī)制可能是通過(guò)影響機(jī)體生物學(xué)環(huán)境和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用。有學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，體外沖擊波治療后骨壞死區(qū)出現(xiàn)明顯的成骨過(guò)程，且伴有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)增多[16-17]。Takahashi等[18]也發(fā)現(xiàn)，體外沖擊波可促使成骨細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白相關(guān)基因從而促進(jìn)成骨。王大偉等[19]研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可干預(yù)股骨頭缺血性壞死兔骨保護(hù)骨素基囚的表達(dá)，從而起到治療作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)兔進(jìn)行激素造模，觀察到A組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)股骨頭壞死局部OPG表達(dá)較B組均低，且隨著時(shí)間推移逐漸降低，并逐漸出現(xiàn)成骨細(xì)胞核固縮、空骨陷窩增加等典型的激素性股骨頭壞死病變。而B(niǎo)股骨頭局部OPG表達(dá)均較A組增強(qiáng)，也未出現(xiàn)典型骨壞死病理改變，說(shuō)明ESWT對(duì)股骨頭缺血壞死的過(guò)程有干預(yù)作用，可能是ESWT干預(yù)了激素對(duì)OPG轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的抑制作用，或是直接促進(jìn)OPG的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而阻斷兔激素性股骨頭壞死骨丟失這一過(guò)程。在ESWT干預(yù)第2周時(shí)B組GMP-140、TM均較A組降低，OPG含量B組較A組無(wú)明顯變化；第4周及8周時(shí)B組GMP-140、TM均較A組降低，OPG含量較A組高，可能是ESWT對(duì)GMP-140、TM表達(dá)直接的抑制作用或是通過(guò)其他途徑間接致其表達(dá)降低，ESWT對(duì)局部OPG表達(dá)有優(yōu)先促進(jìn)作用或是通過(guò)直接促進(jìn)局部OPG表達(dá)進(jìn)而使血漿中OPG含量增高。

綜上所述，ESWT可干預(yù)兔激素性股骨頭缺血壞死的病變過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血漿中的GMP-140、TM、OPG的表達(dá)有影響，但究竟是直接作用還是間接干預(yù)仍不十分清楚，還有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2014-05-28） （本文編輯：蔡元元）endprint

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