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(青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 青島 266003)

氨磷汀對荷瘤鼠放療后腫瘤保護作用

牟俊俊，安永恒

(青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 青島 266003)

目的探討氨磷汀對C57BL/6荷瘤鼠放療后腫瘤組織的保護作用及其對放療效果的影響。方法培養(yǎng)Lewis肺癌細胞株，傳代，制成單細胞懸液，調整細胞密度至106/L，小鼠右下肢皮下注射制備荷瘤鼠模型。隨機分為放療+氨磷汀組(A組)、放療組(B組)、氨磷汀組(C組)、對照組(D組),各8只。放療前給予A組、C組荷瘤鼠腹腔注射5 mL氨磷汀溶液(8 g/L)，B組、D組給予同等劑量生理鹽水腹腔注射，30 min后A組、B組荷瘤鼠局部照射6 MV的X線10 Gy。每2 d測量小鼠體質量及腫瘤體積；15 d后處死小鼠，TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡率。結果A、B、C、D組小鼠各時間點體質量差異均無顯著意義(P>0.05)。第1天4組荷瘤鼠腫瘤體積比較差異無顯著意義(P>0.05)，第3～13天A組腫瘤體積較其他3組減小，B組腫瘤體積較C、D組減小，差異有顯著意義(F=4.290～15.470，P<0.05)；A組與B組比較、C組與D組比較，差異無顯著意義(P>0.05)。A組腫瘤細胞凋亡率高于其他3組，B、C組高于D組，差異均有顯著意義(F=36.535,P<0.01)；B組、C組比較，差異無顯著意義(P>0.05)。結論氨磷汀對腫瘤組織沒有明顯的保護作用，不影響放療效果；氨磷汀可能具有促進腫瘤細胞凋亡的作用。

氨磷汀；放射療法；免疫組織化學；細胞凋亡

放射治療是惡性腫瘤的重要治療手段，放療的副作用常常導致治療終止，影響病人預后。細胞保護劑能減輕放療副作用，其最理想的效應是能夠減輕腫瘤治療中的毒性反應和副作用，不影響腫瘤的治療效果[1-2]。大量研究結果證明，細胞保護劑氨磷

汀能夠明顯減輕放化療引起的多種組織的早期和晚期損傷，包括心臟、腸道細胞、肺組織、腺體、骨組織等[3-5]，使病人治療過程中耐受程度大大提高，從而確保了治療的完成。但是氨磷汀保護正常組織的同時對腫瘤細胞是否同樣具有保護作用，其對放療效果是否具有一定程度的削弱作用，目前仍是本專業(yè)領域所顧慮的問題。本文觀察氨磷汀對放療過程中的腫瘤組織是否具有保護作用，以期對臨床合理應用此藥提供實驗參考。現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1主要材料

Lewis肺癌細胞株，購自青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院中心實驗室；C57BL/6小鼠32只，雄性，6～8周齡，體質量18～20 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；氨磷汀(每支400 mg，大連美羅大藥廠生產(chǎn))，以生理鹽水稀釋至8 g/L；DMEM高糖培養(yǎng)液(Hyclone公司)；澳洲源胎牛血清，青霉素-鏈霉素雙抗(Hyclone公司)；TUNEL細胞凋亡試劑盒(美國羅氏公司)；美國Varian公司直線加速器(我院腫瘤放療科提供)。

1.2Lewis肺癌細胞株的培養(yǎng)及動物模型制備

將Lewis肺癌細胞株以含體積分數(shù)0.10胎牛血清、體積分數(shù)0.01青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，每1～2 d換液一次。顯微鏡下觀察細胞生長狀況，待細胞貼壁面積達80%左右時進行傳代。調整Lewis肺癌單細胞懸液密度為106/L，每只小鼠右下肢皮下注射0.2 mL，2～3 d后可見腫瘤生長[6]，成瘤率為100%，荷瘤鼠模型制備成功。飼養(yǎng)1周后荷瘤鼠即可用于實驗。

1.3實驗分組及處理

將荷瘤鼠隨機分為放療+氨磷汀組(A組)、放療組(B組)、氨磷汀組(C組)、對照組(D組)，每組8只。A組、C組小鼠均腹腔注射8 g/L的氨磷汀溶液5 mL，B組、D組給予等體積生理鹽水腹腔注射。30 min后，A組、B組小鼠水合氯醛全麻后固定，右下肢腫瘤區(qū)局部給予6 MV的X線源皮距照射，源皮距=100 cm，深度=3 cm，加 1 cm組織補償，劑量(DT)=10 Gy。

1.4觀察指標及方法

照射后每2 d測量各組小鼠的體質量、腫瘤最長徑(a)和最短徑(b)，共測量7次，計算腫瘤體積(V)：V=ab2π/6。并于15 d后脫頸椎法處死荷瘤鼠，完整剝?nèi)∧[瘤組織，石蠟包埋、切片后，TUNEL法測腫瘤細胞凋亡率。

1.5統(tǒng)計學處理

應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1各組荷瘤鼠體質量比較

A、B、C、D組間各時間點荷瘤鼠體質量比較，差異均無統(tǒng)計學意義(F=0.775～2.284，P>0.05)。A組、B組小鼠體質量先減少后增加，差異有顯著性(F=2.734、5.517，P<0.05)；C組、D組小鼠體質量逐漸增加，差異有顯著性(F=5.517、12.062，P<0.05)。見表1。

2.2各組荷瘤鼠腫瘤體積比較

第1天4組荷瘤鼠腫瘤體積差異無顯著意義(F=1.201，P>0.05)，第3～13天A組腫瘤體積較其他3組減小，B組腫瘤體積較C、D組減小，差異均有顯著性(F=4.290～15.470，P<0.05);A、B組比較，C、D組比較，差異無顯著性(P>0.05)。A組腫瘤體積第9天達到最大值，B組、C組腫瘤體積第13天達到最大值，D組腫瘤體積第5天達到最大值，差異均有顯著性(F=3.267～10.814，P<0.01)。見表2。

2.3各組腫瘤細胞凋亡率比較

A組腫瘤細胞凋亡率為0.065 7±0.010 9，B組為0.045 8±0.086 9，C組為0.043 4±0.006 0，D組為0.022 4±0.006 6。A組腫瘤細胞凋亡率高于其他3組，B、C組高于D組，差異均有顯著性(F=36.535,P<0.01)；B組、C組比較，差異無顯著性(P>0.05)。各組腫瘤細胞TUNEL染色結果見圖1。

表1 各組荷瘤鼠體質量比較

表2 各組荷瘤鼠不同時間腫瘤體積比較

A：A組，B：B組，C：C組：D：D組。TUNEL染色，400倍。

3 討 論

氨磷汀是半胱氨酸硫磷酸鹽，本身無活性，它在體內(nèi)被堿性磷酸酶水解脫磷酸轉化成有活性的代謝產(chǎn)物——含自由巰基的WR-1065，通過清除放射線所產(chǎn)生的自由基并且提供DNA損傷修復所需要的氫離子，從而發(fā)揮細胞保護作用[7-10]。氨磷汀是目前臨床上較為公認的細胞保護劑，一定程度上可減輕放化療毒性。

本實驗研究氨磷汀對腫瘤細胞有無保護作用，是否會影響放射治療效果。結果顯示，A組、B組、C組與D組小鼠各時間點體質量差異無顯著性，提示在放療前30 min使用氨磷汀對腫瘤組織沒有明顯保護作用，對放射治療效果沒有明顯影響。其可能原因：①氨磷汀發(fā)揮作用依賴于堿性磷酸酶的活性，正常組織堿性磷酸酶活性較高，所以氨磷汀及其代謝產(chǎn)物在正常組織中的濃度遠遠高于腫瘤組織(約100倍)[11]；②正常組織對氨磷汀的攝取是通過濃度依賴載體介導的擴散方式，而腫瘤組織依靠被動轉運方式攝取氨磷汀，后者速度遠低于前者[12]；③90%的氨磷汀在6 min內(nèi)可從血漿內(nèi)清除，其半衰期極短[13]。

本文結果還顯示，第1天4組荷瘤鼠腫瘤體積比較差異無顯著性，第3～13天A組腫瘤體積較其他3組減小，B組腫瘤體積較C、D組減小，差異有顯著性，提示放療對腫瘤的增殖有一定的抑制作用，氨磷汀對腫瘤組織無保護作用。本文A組腫瘤細胞凋亡率高于其他3組，B、C組高于D組，差異均有顯著性；B組、C組比較，差異無顯著性。提示氨磷汀可能對腫瘤細胞的凋亡具有促進作用。其機制可能為與p53基因誘導凋亡具有協(xié)同作用，也可能通過p53途徑實現(xiàn)。

綜上所述，腫瘤放射治療前應用氨磷汀可減輕放射治療相關副作用，其在保護正常組織細胞的同時對腫瘤細胞沒有明顯的保護作用；并且氨磷汀能夠一定程度促進腫瘤細胞凋亡，提高放射治療效果。

[1] 李欣,金潤銘. 阿米福汀在腫瘤治療中的保護作用[J]. 華中醫(yī)學雜志, 2005,29(5):394-395.

[2] 黃平,丁惠萍. 氨磷汀[J]. 中國新藥雜志, 2000,9(10):724-725.

[3] 謝昶,陳永樂. 氨磷汀對細胞保護作用的研究現(xiàn)狀[J]. 國外醫(yī)藥:抗生素分冊, 2001,22(2):84-90.

[4] TCHANQUE-FOSSUO C N, DONNEYS A, DESHPANDE S S, et al. Amifostine remediates the degenerative effects of radiation on the mineralization capacity of the murine mandible[J]. Plast Reconstr Surg, 2012,129(4):646e-655e.

[5] OZDEMIR C S, BURGAZLI K M, BEKEN-OZDEMIR E, et al. The effect of Amifostine (Ethyol) on intestinal anastomosis in rats with radiation enteritis[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2013,17(10):1351-1359.

[6] 王玉坤,劉希光,張紅軍. TRAIL聯(lián)合放射線對肺癌細胞增殖及凋亡影響[J]. 齊魯醫(yī)學雜志, 2013,28(2):98-101.

[7] YAVUZ A A, AYDIN F, YAVUZ M N, et al. Radiation therapy and concurrent fixed dose amifostine with escalating doses of twice-weekly gemcitabine in advanced pancreatic can-cer[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2001,51(4):974-981.

[8] PHAN T P, CRANE C H, JANJAN N A, et al. WR-2721 reduces intestinal toxicity from concurrent gemcitabine and radiation treatment[J]. Int J Pancreatol, 2001,29(1):19-23.

[9] 周曙華,劉亞,邱?？? 氨磷汀在腫瘤放化療中保護作用的文獻分析[J]. 海峽藥學, 2011,23(2):68-70.

[10] 孫菊林. 阿米福汀同步放化療治療腫瘤臨床使用優(yōu)勢觀察研究[J]. 中國民族民間醫(yī)藥, 2011,20(12):24-25.

[11] HENSLEY M L, SCHUCHTER L M, LINDLEY C, et al. American society of clinical oncology clinical practice guidelines for the use of chemotherapy and radiotherapy protectants[J]. J Clin Oncol, 1999,17(10):3333-3355.

[12] 王茂生,李君. 細胞保護劑阿米福汀在惡性腫瘤治療中的應用[J]. 中國醫(yī)師進修雜志, 2006,29(33):73-74.

[13] 王根菊,韓國榮. Amifostine在腫瘤化療中作用的研究進展[J]. 東南大學學報:醫(yī)學版, 2006,25(2):139-142.

[14] PATAER A, FANALE M A, ROTH J A, et al. Induction of apoptosis in human lung cancer cells following treatment with amifostine and an adenoviral vector containing wild-type p53[J]. Cancer Gene Ther, 2006,13(8):806-814.

(本文編輯 黃建鄉(xiāng))

THEPROTECTIVEEFFECTOFAMIFOSTINEONTUMORINCANCER-BEARINGMICEAFTERRADIOTHERAPY

MOUJunjun,ANYongheng

(Oncology Department, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo explore the protection effect of Amifostine (AMI) on tumor tissues in cancer-bearing mice after radiotherapy (RT) and its influence on efficacy of the therapy.MethodsA cultivation and passage of Lewis lung cancer lines were carried out, and single-cell suspension made, the cell density was then modulated to 106/L and subcutaneously injected to right lower limb to create a cancer-bearing model in mice. The mice were randomized to four groups as group A (AMI+RT), group B (RT), group C (AMI), and control group, with eight mice in each group. Before radiotherapy, an intraperitoneal injection of 5 mL (8 g/L) AMI was offered to the mice in group A and group C, a same dose of normal saline was given to those in group B and control group, 30 minutes later, the mice in groups A and B received local irradiation (6 MV-X, 10 Gy). The body weight and gross tumor volume were measured every two days. Fifteen days later, the mice were sacrificed for detecting apoptosis of tumor cells using TUNEL method.ResultsThe differences of body weight between the mice in the four were not significant (P>0.05). On the first day, tumor volume in the mice between the four groups were not significantly different (P>0.05), on days 3 to 13, the tumor volume in the mice of group A was decreased versus the other three groups, and that in group B was smaller than that in groups C and D, the differences being significant (F=4.290-15.470,P<0.05), and the difference between groups A and B, as well as C and D, no significant differences were noted (P>0.05). The cell apoptosis in group A was higher than that in the other three groups, and that in groups B and C was higher than that in group D, the differences were significant (F=36.535,P<0.01), and the difference of that between groups B and C was not significant (P>0.05).ConclusionAmifostine does not protect tumor tissues and affect the efficacy of radiotherapy. It’s likely that Amifostine has an action to promote apoptosis of tumor cells.

amifostine; radiotherapy; immunohistochemistry; apoptosis

2013-10-26;

2014-03-26

牟俊俊(1986-)，女，在讀碩士研究生。

安永恒(1961-)，男，碩士，主任醫(yī)師,碩士生導師。

R734.2

A

1008-0341(2014)03-0213-03