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(1 青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院脊柱外科，山東 青島 266003; 2 中國人民解放軍第107醫(yī)院)

·腫瘤學研究·

FQ-PCR法檢測人骨肉瘤MG63細胞系中β-catenin基因表達

張鵬1，李書忠1，張明進1，張豹1，曲邵政2

(1 青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院脊柱外科，山東 青島 266003; 2 中國人民解放軍第107醫(yī)院)

目的研究β-catenin基因在人骨肉瘤MG63細胞內(nèi)表達的變化。方法培養(yǎng)人骨肉瘤MG63細胞，不同濃度Wnt3a及WIF-1蛋白刺激MG63細胞，用實時熒光定量PCR(FQ-PCR)法測定細胞中β-catenin mRNA表達水平。培養(yǎng)人骨肉瘤MG63細胞，用90 μg/L的Wnt3a及WIF-1刺激細胞，分別于12、24、48、72、96 h對各組細胞進行計數(shù)，觀察空白組、Wnt3a及WIF-1組細胞數(shù)目變化情況。結果不同濃度WIF-1組β-catenin mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義(F=215.58，P<0.05)，隨著WIF-1濃度的增高而呈遞減趨勢;不同濃度Wnt3a組β-catenin mRNA的表達差異有統(tǒng)計學意義(F=185.64，P<0.05),隨著Wnt3a濃度的增高而呈遞增趨勢?？瞻捉M細胞增殖情況優(yōu)于WIF-1組，低于Wnt3a組,差異有統(tǒng)計學意義(F=4.88，P<0.05)。結論不同濃度Wnt3a及WIF-1刺激下β-catenin基因在人骨肉瘤MG63細胞內(nèi)表達的變化，證明wnt/β-catenin信號通路對人骨肉瘤MG63細胞有重要的調(diào)控作用。

骨肉瘤；基因，β-catenin；聚合酶鏈反應

骨肉瘤是兒童及青少年時期常見的骨腫瘤之一，好發(fā)于10～20歲，約占骨惡性腫瘤的20%[1-2]。近年來，化療方案的完善及化療藥物的更新使得骨肉瘤病人的生存率有了明顯的提高[3-4]。然而，肺轉(zhuǎn)移及骨腫瘤復發(fā)仍然是骨肉瘤病人長期生存的限制性因素。Wnt/β-catenin 信號轉(zhuǎn)導通路在多種細胞的增殖、分化中扮演重要角色。 PEIFER等[5]研究顯示，Wnt信號在骨細胞的基因信號轉(zhuǎn)導中起重要作用。本研究通過將外源性Wnt3a 及 WIF-1作用于MG63細胞，在基因水平觀察β-catenin的表達情況，進而探討Wnt/β-catenin 信號轉(zhuǎn)導通路在骨肉瘤發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1主要材料

人骨肉瘤細胞株MG63(中國科學院上海生物細胞研究所)，Wnt3a蛋白干粉、WIF-1蛋白(美國R&D公司)，PCR試劑盒(TaKara公司)，β-catenin、GAPDH引物(大連寶生物工程有限公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) MG63細胞株置于DMEM高糖培養(yǎng)液(添加體積分數(shù)0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素及100 mg/L鏈霉素)中，在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞70%融合時進行傳代，吸除舊培養(yǎng)液，加入胰蛋白酶少許，以能覆蓋瓶底為宜，倒置顯微鏡下觀察到細胞胞質(zhì)回縮、間隙增大時加入培養(yǎng)液以終止消化。吸管吸取培養(yǎng)液，輕輕反復吹打瓶壁細胞，使之呈細胞懸液。按1∶2比例進行傳代。

1.2.2不同濃度Wnt3a、WIF-1蛋白刺激MG63細胞 取對數(shù)生長期的MG63細胞，傳代后接種到6孔板中的5孔中，于恒溫箱中進行培養(yǎng)。待每孔大約70%的細胞融合時，加入不同濃度的Wnt3a及WIF-1溶液刺激MG63細胞24 h。

1.2.3實時熒光定量PCR(FQ-PCR)法檢測β-catenin基因的表達 對上述加入Wnt3a及WIF-1溶液培養(yǎng)24 h的細胞采用TRIzol法提取RNA，用紫外線分光光度計根據(jù)波長260 nm處的吸光度值測定RNA的純度，并進行定量。用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(code:DDR047S)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用PCR試劑盒(Code:DRR081A)對目的基因及內(nèi)參照進行擴增。β-catenin的上游引物為5′-TGAGGACAAGCCACAAGATTAC-3′，下游引物為5′-TCCACCAGAGTGAAAAGAACG-3′；GAPDH的上游引物為5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,下游引物為5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR反應體系為25 μL，含Premix Ex TaqTMⅡ(2×)12.5 μL，10 μmol/L PCR Forward Primer和Reverse Primer各1 μL,DNA模板2 μL,dH2O 8.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。按照Livak公式計算目的基因β-catenin的相對表達量,其相對表達量采用2-△△CT表示。

1.2.4細胞形態(tài)學觀察 將人骨肉瘤MG63細胞計數(shù)后等分接種于3盤30 mm×60 mm大小的培養(yǎng)基中，空白組用DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，Wnt3a組及WIF-1組分別用含90 μg/L Wnt3a、WIF-1的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)相同時間后于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.5Wnt3a及WIF-1蛋白刺激下細胞生長情況將處于對數(shù)生長期的MG63細胞接種于48孔培養(yǎng)板，其初始細胞數(shù)約為103個，空白組、Wnt3a組及WIF-1組分別用DMEM高糖培養(yǎng)液、含90 μg/L Wnt3a及WIF-1的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。每天換液，各組分別于12、24、48、72、96 h取4孔細胞，滴入錐蟲藍染液后在計數(shù)器上計數(shù)。按每天細胞平均數(shù)目繪制細胞生長曲線。

1.3統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1不同濃度Wnt3a及WIF-1蛋白刺激下β-catenin mRNA的表達

空白組2-△△CT均為1；30、60、90、120 μg/L WIF-1組2-△△CT分別為0.55±0.05、0.44±0.04、0.35±0.04、0.24±0.03；30、60、90、120 μg/L Wnt3a組2-△△CT分別為1.96±0.06、2.08±0.15、2.84±0.09、3.29±0.17。隨著WIF-1濃度的增高，β-catenin mRNA表達量下降，差異有統(tǒng)計學意義(F=215.58，P<0.05)；隨著Wnt3a濃度的增高，β-catenin mRNA表達量增加，差異有統(tǒng)計學意義(F=185.64，P<0.05)。

2.2細胞形態(tài)學觀察

各組細胞均呈貼壁生長，細胞形態(tài)均呈梭形；Wnt3a組細胞較空白組細胞排列緊密，WIF-1組細胞較空白組細胞排列稀疏。

2.3細胞生長曲線的測定

以細胞培養(yǎng)時間為橫坐標，細胞計數(shù)為縱坐標，繪制生長曲線。WIF-1組細胞增殖速度較空白組減慢，空白組細胞增殖速度較Wnt3a組減慢，差異有統(tǒng)計學意義(F=4.88，P<0.05)。見圖1。

圖1 各組細胞生長曲線

3 討 論

骨肉瘤是青少年及年輕人最常見的惡性骨腫瘤之一[1-2，6]。近年來，新化療藥物雖屢屢出現(xiàn)，但轉(zhuǎn)移瘤及骨腫瘤復發(fā)仍影響病人長期生存[7]。闡明骨肉瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移及復發(fā)的機制，提供針對性靶向治療是

目前最需迫切解決的問題。隨著分子生物學的發(fā)展，包括p53基因、p16基因、 FFEN基因、Survivin、CTRP3等在內(nèi)的骨肉瘤信號轉(zhuǎn)導途徑及作用逐步被發(fā)現(xiàn)，使人們對骨肉瘤發(fā)病機制有了新的認識。

在信號轉(zhuǎn)導通路中，Wnts作為由半胱氨酸殘基組成的分泌型糖蛋白家族，對組織細胞的生長發(fā)育發(fā)揮重要作用，因此，近年來受到了廣泛關注[8]。Wnts信號轉(zhuǎn)導通路包括經(jīng)典型和非經(jīng)典型通路兩種。在經(jīng)典型通路中，活化的Wnt與膜受體Fz及LRP5、6結合激活轉(zhuǎn)導通路，促進下游Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄；抑制Wnt通路時，被酪蛋白激酶-1和GSK-3β磷酸化的β-catenin泛素化而使蛋白酶破壞，進而抑制Wnt靶基因轉(zhuǎn)錄[9]。非經(jīng)典型Wnt通路主要包括Wnt/Ca2+、Wnt/PCP等信號通路，目前具體作用機制尚不清楚。

Wnt在多種細胞的分化、增殖及生長調(diào)節(jié)中起重要作用。KARIM等[10]結果表明，許多腫瘤的發(fā)生與Wnt信號轉(zhuǎn)導通路有聯(lián)系。MATSUDA[11]和LEE[12]的研究結果顯示，Wnt信號在乳癌、肝癌的發(fā)病中起重要作用。HE等[13]也曾報道結直腸癌的發(fā)生與Wnt信號的紊亂有關。BARKER等[14]研究顯示，活化的Wnt信號通路與多種人類腫瘤的發(fā)生緊密相關。CHEN等[15]研究顯示，骨肉瘤可由Wnt10b誘導而產(chǎn)生，且腫瘤的遷移及生長與其相關。激活Wnt5a/Ror2信號轉(zhuǎn)導通路，骨肉瘤細胞株U2OS侵襲性增強；其侵襲性也可因該通路的阻斷而抑制[16]。HOANG等[17]研究顯示，LRP5作為Wnt信號轉(zhuǎn)導通路中重要受體，在骨肉瘤惡化進程中可以作為標志物來預測轉(zhuǎn)歸。而CAI等[18]研究顯示，活化Wnt/β-catenin信號通路可抑制骨肉瘤細胞的增殖；失活的Wnt/β-catenin信號通路反而促進骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。

本實驗體外培養(yǎng)人骨肉瘤MG63細胞，通過加入外源性Wnt3a及WIF-1蛋白來刺激經(jīng)典Wnt信號通路，然后采用FQ-PCR技術檢測細胞內(nèi)β-catenin基因表達。FQ-PCR技術具有高擴增效率、高擴增靈敏度、高擴增特異性等優(yōu)點，并且能在寬廣的范圍內(nèi)進行更準確的定量[19-20]。實驗表明，Wnt3a激活人骨肉瘤MG63細胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路，強化Wnt信號通路下游通路β-catenin，從而增加MG63細胞數(shù)量；WIF-1刺激下β-catenin mRNA表達量均降低，隨著WIF-1濃度的增加，其表達抑制作用更明顯。通過細胞生長曲線繪制及倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及細胞生長密集程度也同樣證實了該觀點。本研究提示，Wnt/β-catenin信號通路在骨肉瘤細胞生長、增殖、凋亡中發(fā)揮了重要作用，為進一步研究骨肉瘤基因水平的分子靶向治療提供了依據(jù)。但Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路中具體分子的相互作用機制尚不清楚。另外，本研究局限于體外實驗，體內(nèi)Wnt/β-catenin的具體作用機制尚需進一步研究。

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(本文編輯 馬偉平)

DETECTIONOFβ-CATENINEXPRESSIONINHUMANOSTEOSARCOMAMG63CELLLINEUSINGFQ-PCR

ZHANGPeng,LIShuzhong,ZHANGMingjin,ZHANGBao,QUShaozheng

(Spine Surgery Department, The Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo study the expression of β-catenin expression in human osteosarcoma MG63 cell line.MethodsHuman MG63 cells interfered with Wnt3a and WIF-1 in different concentrations was cultured. The expression of β-catenin was detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR). Culturing human MG63 cells, interfered with the same concentration of Wnt3a and WIF-1 (90 μg/L), the cells were counted respectively at 12, 24, 48, 72 and 92 hours in each group, the cell number in the blank-observation group, Wnt3a group and WIF-1 group was observed.ResultsThe differences of β-catenin expression between different-concentration WIF-1 groups were significant (F=215.58,P<0.05), the expression tended to decrease along with the increase of WIF-1 concentration; The differences of β-catenin expression between different-concentration Wnt3a groups were significant (F=185.64,P<0.05), the expression increased by degrees along with the increase of the concentration of Wnt3a. The blank group was found to have a higher cell proliferation than WIF-1 group, and lower than Wnt3a group, the difference was significant (F=4.88,P<0.05).ConclusionThe changes of the expressions of β-catenin in MG63 cells stimulated by different concentrations of Wnt3a and WIF-1 prove that Wnt/β-catenin signal pathway play an important regulation role in human osteosarcoma MG63 cells.

osteosarcoma; genes, β-catenin; polymerase chain reaction

2013-09-03;

2013-12-06

張鵬(1988-)，男，在讀碩士研究生。

李書忠(1958-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導師。

R738.1

A

1008-0341(2014)03-0189-04