張偉斌　陳丹　馬偉欽　何興祥　陳羽　王麗京

【摘要】 目的：利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分離、鑒定結(jié)直腸癌有無(wú)肝轉(zhuǎn)移患者血清中差異蛋白質(zhì)，篩選診斷肝轉(zhuǎn)移的血清蛋白標(biāo)志物。方法：根據(jù)入組條件，收集結(jié)直腸癌無(wú)肝轉(zhuǎn)移病例、有肝轉(zhuǎn)移病例，在兩組中隨機(jī)抽取12例血清樣本，同組血清等量混合進(jìn)行雙向凝膠電泳，建立兩組血清蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，用Image-Master V5.0軟件尋找兩組差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，MALDI-TOF-MS對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，查詢生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行初步分析。結(jié)果：兩組比較差異在2倍以上蛋白質(zhì)有8種，其中5個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，3個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)；兩組每個(gè)差異蛋白灰度體平均值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定出7種蛋白質(zhì)，上調(diào)的5個(gè)蛋白質(zhì)分別是Transferrin、Complement component C9、RNA directed DNA polymerase（RNA指導(dǎo)的DNA合成酶）、Conserved hypothetical-protein（假定蛋白質(zhì)）、SEC14L1 7 kDa protein；下調(diào)的2個(gè)蛋白質(zhì)分別是Haptoglobin和Isoform 1 of Serum albumin。結(jié)論：結(jié)直腸癌有無(wú)肝轉(zhuǎn)移患者血清中的蛋白質(zhì)表達(dá)譜有一定的差異性，這些差異蛋白質(zhì)可能成為診斷肝轉(zhuǎn)移的血清標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)直腸癌； 肝轉(zhuǎn)移； 差異蛋白質(zhì)

近年來(lái)大量統(tǒng)計(jì)資料表明，在我國(guó)結(jié)直腸癌腸癌發(fā)病率和死亡率逐年升高盡管診療新技術(shù)不斷改進(jìn)和化療藥物的更新，其整體治療水平仍不盡人意，主要原因是在行根治性手術(shù)前出現(xiàn)了肝臟的轉(zhuǎn)移。因此，早期有效地診斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移具有重要的臨床意義，是徹底改變結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)鍵措施。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選及鑒定結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移關(guān)鍵血清蛋白標(biāo)志物，進(jìn)一步了解結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年5月-2011年11月本院經(jīng)病理明確診斷為結(jié)直腸癌的患者88例，并且患者既往無(wú)其他腫瘤，術(shù)前未接受過(guò)放療、化療等治療；無(wú)姑息性手術(shù)者；無(wú)肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝癌以及急慢性炎癥性疾病等影響血清蛋白含量的相關(guān)疾病患者。影像學(xué)檢查（B超、CT或MRI）檢查發(fā)現(xiàn)有肝轉(zhuǎn)移灶者為結(jié)直腸癌有肝轉(zhuǎn)移組，無(wú)發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移灶者為結(jié)直腸癌無(wú)肝轉(zhuǎn)移組。均征得患者同意入組。88例直腸癌患者中直腸癌38例，結(jié)腸癌50例；無(wú)肝轉(zhuǎn)移患者62例，伴肝轉(zhuǎn)移患者26例。結(jié)直腸癌無(wú)肝轉(zhuǎn)移組男33例，女29例，平均年齡（55.8±13.8）歲；結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移組男11例，女15例，平均年齡（58.1±8.7）歲。兩組患者的年齡、性別等比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑、儀器、軟件 硫脲、除高峰度蛋白試劑盒、碳酸鈉（Na2CO3）、碳酸氫鈉，尿素、Tris堿、3-[3-（膽酰胺基丙基）二甲氨基]丙磺酸鹽、二硫蘇糖醇、溴酚藍(lán)、甘油、十二烷基磺酸鈉、過(guò)硫酸銨、丙烯酰胺、N，N-亞甲基丙烯酰胺、四甲基乙二胺、低熔點(diǎn)瓊脂糖、固相pH值干膠條、蛋白質(zhì)純化試劑盒、定量試劑盒、考馬斯亮藍(lán)、冰醋酸（glacial acetic acid）、丁醇（butanol）。DU530型核酸/蛋白分析儀（美國(guó) Beckman）；IPGphor等電聚焦儀，Ettan DALT six大型垂直電泳系統(tǒng)、掃描儀ImageScanner和LabScan軟件（Amersham Biosciences）；質(zhì)譜儀Ultraflex III（美國(guó)布魯克）等。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)樣品制備 早晨抽取研究對(duì)象空腹靜脈血5 mL于干燥管收集，干燥管編號(hào)，記錄患者信息。37 ℃靜置30～60 min，3400 rpm離心15 min，取上層清亮透明血清，在這個(gè)過(guò)程中應(yīng)盡量避免發(fā)生溶血，如若溶血標(biāo)本，棄去。每個(gè)EP管500 ?L血清分裝，并編號(hào)，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。結(jié)直腸癌無(wú)肝轉(zhuǎn)移及伴有肝轉(zhuǎn)移組分別隨機(jī)選取各12例標(biāo)本，同組標(biāo)本取等量混合，除高豐度蛋白，Clean-up kit純化后用Quant kit測(cè)定蛋白濃度。

1.3.2 雙向電泳 第1向等電聚焦，上樣量總體積為460 ?L（含總蛋白質(zhì)500 ?g）；以13 200 rpm 4 ℃離心30 min，去上清液；放置IPG膠條并確保膠條與樣品之間無(wú)氣泡，膠條吸脹15 min；依次經(jīng)過(guò)30 V 12 h、500 V 1 h、1000 V 1 h、8000 V 6 h、2000 V 10 h。等電聚焦結(jié)束后，將IPG膠條置于平衡緩沖液中15 min。將平衡好的膠條轉(zhuǎn)入垂直電泳槽中進(jìn)行第2向電泳。后考馬斯亮藍(lán)G-250染色對(duì)電泳凝膠進(jìn)行染色。

1.3.3 凝膠圖像掃描與分析 用Image Scanner掃描儀同一參數(shù)（300 dpi）掃描并用Image Master V5.0進(jìn)行圖像分析，對(duì)膠上蛋白質(zhì)斑點(diǎn)通過(guò)編輯，背景消除，分析膠間的匹配，獲取差異蛋白點(diǎn).

1.3.4 差異蛋白點(diǎn)肽質(zhì)量指紋分析及鑒定 挖取出差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，進(jìn)行蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解后獲得蛋白質(zhì)酶解肽段，將肽段點(diǎn)樣于MALDI板上，進(jìn)行MALDI-TOF/TOF-MS鑒定分析。Mascot軟件檢索Human的IPI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，參數(shù)設(shè)置如下：種屬為human，切割酶combined，允許的未酶切位點(diǎn)數(shù)為1，酶為胰蛋白酶，MS的誤差30 ppm，MS/MS的誤差為0.2 Da。MS和MS/MS結(jié)果聯(lián)合搜索，得分超過(guò)63分為超過(guò)閾值（P<0.05），為可信的鑒定結(jié)果，并根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定出蛋白質(zhì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 測(cè)定結(jié)果輸入計(jì)算機(jī)，數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙向電泳結(jié)果 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，銀染顯色后得到兩組共6張背景清晰、分辨率高的銀染凝膠圖譜（圖1、圖2），后用圖像分析軟件Image Master 2D Platinum對(duì)圖像進(jìn)匹配分析。在匹配分析過(guò)程中得到具有差異蛋白質(zhì)局部放大圖（圖3）以及其三維空間圖（圖4）。在匹配分析中選擇差異倍數(shù)大于2倍以上為差異蛋白質(zhì)。分析示有8個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)，其中肝轉(zhuǎn)移組中5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)且大于2倍的，3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)下調(diào)調(diào)且大于2倍，并計(jì)算8個(gè)差異蛋白點(diǎn)3次電泳膠的灰度體平均值，兩組每個(gè)差異蛋白灰度體平均值比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。endprint

2.2 差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜圖及鑒定 從肝轉(zhuǎn)移組凝膠中切下的8個(gè)差異表蛋白質(zhì)點(diǎn)，進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定，獲取的質(zhì)譜圖（圖5、圖6）。

并經(jīng)過(guò)Mascot軟件檢索human的IPI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，按Mascot得分、匹配的片段數(shù)和覆蓋率等進(jìn)行綜合評(píng)判搜索結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

近年來(lái)利用手術(shù)切除標(biāo)本、患者血液、腫瘤細(xì)胞等作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移與多種蛋白有關(guān)[1]。結(jié)直腸癌在向肝轉(zhuǎn)移過(guò)程中癌組織會(huì)分泌多種蛋白質(zhì)入血清，而其他器官和組織受到腫瘤影響也會(huì)分泌蛋白質(zhì)，因此從血清蛋白質(zhì)組學(xué)角度進(jìn)行研究很可能會(huì)發(fā)現(xiàn)一些與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的特異性血清標(biāo)志物，目前利用血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移癌癥的有乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌等[2-5]。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分離、鑒定結(jié)直腸癌有無(wú)肝轉(zhuǎn)移患者血清中差異蛋白質(zhì)，并通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定出8種蛋白質(zhì)（其中有2個(gè)蛋白質(zhì)同為Haptoglobin），5個(gè)上調(diào)的蛋白質(zhì)分別是Transferrin、Complement component C9、RNA directed DNA polymerase（RNA指導(dǎo)的DNA合成酶）、Conserved hypothetical -protein（假定蛋白質(zhì)）、SEC14L1 7 kDa protein；2個(gè)下調(diào)的蛋白質(zhì)分別是Haptoglobin和Isoform 1 of Serum albumin。

Transferrin產(chǎn)生的主要器官是肝臟，它是一種重要的β-球蛋白，是體液中不可缺少的成分，是細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖所必需的生長(zhǎng)因子。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，Transferrin能改變細(xì)胞的黏附能力，促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，并且在腫瘤和癌細(xì)胞中Transferrin的受體含量顯著高于其相應(yīng)的正常細(xì)胞[6-7]。另有研究通過(guò)對(duì)高危乳腺癌的術(shù)后血清進(jìn)行SELDI-TOF MS表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移后血清中蛋白質(zhì)Transferrin上調(diào)，提示其對(duì)轉(zhuǎn)移具有獨(dú)立預(yù)后意義[8]。李祖國(guó)等[9]通過(guò)建立裸鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型并應(yīng)用血清蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)觀察肝轉(zhuǎn)移前后血清蛋白的變化，結(jié)果示結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移后血清中Transferrin顯著上調(diào)。所以筆者分析當(dāng)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，其表面Transferrin受體的密度迅速增加，待攜帶受體的癌細(xì)胞浸潤(rùn)入血后，與在肝臟產(chǎn)生Transferrin結(jié)合并沉積在肝臟形成轉(zhuǎn)移，Transferrin可能是促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白。另一種上調(diào)的蛋白質(zhì)RNA-directed DNA polymerase是逆轉(zhuǎn)錄酶，目前認(rèn)為是正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞的關(guān)鍵因素，已經(jīng)有學(xué)者通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)結(jié)直腸癌患者外周血人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶表達(dá)率和表達(dá)水平顯著增高，可作為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物[10]。下一步也可通過(guò)熒光定量等技術(shù)檢測(cè)肝轉(zhuǎn)移組血清RNA directed D-polymerase上調(diào)的表達(dá)率和表達(dá)水平，為監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移篩選一個(gè)可靠的蛋白標(biāo)志物。上調(diào)的Complement component C9是一種非特異性蛋白，在腫瘤免疫中作用受到重視，研究表明肝癌患者血清C9水平明顯升高，可作為AFP陰性肝癌敏感的、特異的腫瘤標(biāo)志物之一[11]。本研究中結(jié)直腸癌有肝轉(zhuǎn)移患者血清中上調(diào)倍數(shù)最大的蛋白質(zhì)是Conserved hypothetical protein，它是通過(guò)直接測(cè)序或由cDNA序列翻譯之后，得到的蛋白質(zhì)序列，該序列中存在有某種特定功能的一段保守序列，筆者推測(cè)這段保守序列的特定功能可能是引起結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，將對(duì)其重點(diǎn)研究。

在本研究中發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌有肝轉(zhuǎn)移患者血清中下調(diào)的蛋白質(zhì)是Haptoglobin和Isoform 1 of Serum albumin。Haptoglobin是血清中的一種酸性糖蛋白，廣泛存在于人類的血清中，其功能是作為一種急性期蛋白，在參與宿主抗感染、損傷組織的修復(fù)以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過(guò)程中起著重要作用，其在感染、創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤、心肌梗死等病理狀態(tài)時(shí)顯著升高。其能促進(jìn)新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和分化[12-13]。另它能通過(guò)與游離血紅蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，復(fù)合物運(yùn)至肝臟后它就迅速被肝細(xì)胞從血液清除并釋放血紅蛋白，可導(dǎo)致其降低，所以有研究報(bào)道肝硬化癌變過(guò)程Haptoglobin由高到低[14-15]。本研究結(jié)果示Haptoglobin降低，結(jié)合其功能，筆者推測(cè)在結(jié)直腸癌患者未發(fā)生肝轉(zhuǎn)移時(shí)期，Haptoglobin促進(jìn)腫瘤血管生成，當(dāng)腫瘤血管生成達(dá)到一定程度時(shí)，Haptoglobin與游離血紅蛋白結(jié)合形成復(fù)合物攜帶腫瘤細(xì)胞入血，經(jīng)過(guò)肝臟時(shí)復(fù)合物中的Haptoglobin被肝細(xì)胞清除，血清中Haptoglobin降低，但腫瘤細(xì)胞定植在肝臟形成轉(zhuǎn)移瘤。而本研究特殊情況是Haptoglobin在雙向電泳中顯示為不同的位置，說(shuō)明結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移過(guò)程可能還同時(shí)伴有蛋白質(zhì)修飾的改變參與其中。另下調(diào)蛋白質(zhì)Isoform 1 of Serum albumin是血清白蛋白的異構(gòu)體，白蛋白屬于非急性時(shí)相蛋白，在維持血液膠體滲透壓，體內(nèi)代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及營(yíng)養(yǎng)等方面起著重要的作用，即使肝臟停止合成，8 d后外周血中濃度僅降低20%，由于肝臟有很強(qiáng)的代償能力，半衰期較長(zhǎng)，只有當(dāng)肝臟病變和病程達(dá)到一定程度后才能出現(xiàn)白蛋白的改變。本研究示當(dāng)結(jié)直腸癌出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移時(shí)Isoform 1 of Serum albumin下調(diào)，考慮肝轉(zhuǎn)移后肝細(xì)胞受到破壞，即引起其變化，如定期監(jiān)測(cè)，就可早期發(fā)現(xiàn)有無(wú)肝轉(zhuǎn)移，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，結(jié)直腸腸癌肝轉(zhuǎn)移的形成是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過(guò)程，涉及到多個(gè)基因和多個(gè)蛋白的相互協(xié)同或拮抗作用。本研究的8種差異蛋白質(zhì)可能在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的突變、激活，癌細(xì)胞的粘附、遷移、增殖，細(xì)胞外基質(zhì)降解，組織免疫性及腫瘤血管增生因子等過(guò)程中起到一定作用。筆者已經(jīng)將2種差異蛋白質(zhì)Transferrin、Haptoglobin構(gòu)建人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，建立結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移診斷模型，并通過(guò)橫斷面驗(yàn)證其有較高的準(zhǔn)確度。故對(duì)這些差異蛋白質(zhì)的進(jìn)一步研究，便可早期篩選結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的血清標(biāo)志物。endprint

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（收稿日期：2014-05-03）（本文編輯：蔡元元）endprint

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（收稿日期：2014-05-03）（本文編輯：蔡元元）endprint

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