徐墨　李壯　侯燕妮　李義強(qiáng)

【摘要】 目的：研究抑癌基因WWOX在乳腺癌發(fā)生過程中不同階段的表達(dá)及乳腺癌治療過程中的作用與意義。方法：采用免疫組化SABC法對乳腺正常組織23例、12例乳腺原位癌和45例乳腺浸潤癌組織中WWOX的蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，并結(jié)合臨床病理學(xué)資料進(jìn)行研究。結(jié)果：26.1%（6/23）正常乳腺組織、50.0%（6/12）乳腺原位癌、64.4%（29/45）乳腺浸潤癌組織中WWOX基因蛋白表達(dá)降低或缺失，各期間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。WWOX在Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級乳腺浸潤癌組織分期的降低與缺失表達(dá)率分別為38.5%、61.1%和92.9%，各期間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：抑癌基因WWOX隨著乳腺癌發(fā)生過程不同階段中，基因表達(dá)降低或缺失逐漸升高，提示W(wǎng)WOX在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌； 原位癌； WWOX基因； 抑癌基因

乳腺癌近年來發(fā)病率逐年增高，是女性常見的惡性腫瘤之一。它是一種多因素導(dǎo)致的疾病，自身因素、環(huán)境因素、遺傳因素都有參與其發(fā)生過程。在因子水平中抑癌基因的表達(dá)有著非常重要的作用，臨床已知的抑癌因子有P53、P63、Ki67等等。逐漸尋找并開發(fā)其抑癌機(jī)理成為腫瘤近年來發(fā)展趨勢。Ried與Bednarek等人于2000年發(fā)現(xiàn)的含氧化還原酶ww結(jié)構(gòu)域WWOX因子（ww domain contaming oxidoreductase），WWOX因子于人類普通的染色體脆性位點(diǎn)，包含F(xiàn)RA16D上的（16q23.3-q24.1）區(qū)域近年來被廣泛認(rèn)可為新的抑癌基因[1]。并且以WWOX因子的實(shí)驗(yàn)及文章漸漸增多，使此位點(diǎn)備受關(guān)注。在多種惡性腫瘤如胃腸道癌、卵巢癌、乳腺癌等都有表達(dá)減弱或趨勢表現(xiàn)。目前多為腫瘤培養(yǎng)細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，WWOX因子關(guān)于乳腺癌的臨床研病例究較少，本研究采用免疫組織化學(xué)SABC法檢測正常乳腺組織、乳腺原位癌組織、乳腺浸潤癌組織，以及在乳腺浸潤癌組織分期I級、II級、III級中WWOX基因的降低或缺失表達(dá)與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的過程的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2013年1月-2014年4月本院腫瘤外科手術(shù)切除的乳腺標(biāo)本，通過查閱病例選取乳腺原位癌12例、浸潤癌45例（其中病理組織學(xué)Ⅰ級16例、Ⅱ級13例、Ⅲ級16例）以及正常乳腺組織23例，被選取者為女性，均經(jīng)病理科檢查確診并證實(shí)，且按國際抗癌協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級。患者術(shù)前均無放療、化療等治療。實(shí)驗(yàn)所用兔抗人WWOX單克隆抗體、DAB顯色劑購于上海越研生物科技有限公司。

1.2 免疫組化法染色 通過查閱病例選取病理科的存檔蠟塊，并切片進(jìn)行HE染色，然后按SABC法操作，滴加兔抗人WWOX多克隆抗體（1：100），經(jīng)室溫孵育2 h，再滴生物素標(biāo)記的兔抗羊抗體，37 ℃ 25 min；滴加SABC復(fù)合物，37 ℃ 25 min。后經(jīng)PBS緩沖液沖洗，DAB H2O2液顯色，復(fù)染、脫水、透明、固定。實(shí)驗(yàn)步驟遵循試劑盒上說明。用已知陽性乳腺癌標(biāo)本片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 染色判斷 WWOX因子為細(xì)胞漿表達(dá)染色，實(shí)驗(yàn)以細(xì)胞漿染成棕黃色視為陽性，根據(jù)染色程度、范圍來判定及評分。按程度分為：分為未染色、弱染色、強(qiáng)染色。按范圍分為：<30%、31%～60%、61%～100%。染色的程度乘以范圍得數(shù)為評分，染色評分為1～9（染色程度為1～3，染色范圍為1～3）。評分6～9認(rèn)為是WWOX基因無表達(dá)缺失，2～5為表達(dá)降低，無染色為表達(dá)完全缺失；并且將結(jié)果重復(fù)觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WWOX基因正常在乳腺組織、原位癌及浸潤癌組織中的表達(dá) 23例正常乳腺組織中，強(qiáng)染色表現(xiàn)為74.0%（17/23）（圖1），染色降低為21.7%（5/23），染色缺失為4.3%（1/23）例。12例原位癌乳腺組織中，強(qiáng)染色表現(xiàn)為50.0%（6/12）（圖2），染色降低為33.3%（4/12），染色缺失為16.7%（2/12）例。45例浸潤癌乳腺組織中，強(qiáng)染色表現(xiàn)為35.6%（16/45）（圖3），染色降低為33.3%（15/45），染色缺失為16.7%（14/45）例。三者各期間的染色表現(xiàn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=10.319，P=0.006），見表1。

圖1 WWOX因子于正常乳腺組織中表達(dá)（×40）

圖2 WWOX因子于原位癌組織中表達(dá)（×40）

圖3 WWOX因子于浸潤癌腺組織中表達(dá)（×100）

表1 不同組織中WWOX基因的表達(dá) 例

組織 無染色 弱染色 強(qiáng)染色

正常乳腺（n=23） 1 5 17

原位癌（n=12） 2 4 6

浸潤癌（n=45） 14 15 16

2.2 乳腺癌中WWOX因子與臨床病理學(xué)的關(guān)系 乳腺癌Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者中WWOX表達(dá)完全缺失的比例分別為38.5%、61.1%和92.9%，各期的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=7.190，P=0.027）。

3 討論

無論國內(nèi)外乳腺癌都是一種常見的疾病，目前臨床乳腺癌仍以手術(shù)治療為主，基因程度上的損傷或缺失是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要條件，尤其染色體脆性基因?qū)ζ涓舾?。所以近些年乳腺癌早期診斷及基因?qū)用娴难芯恐饾u興起。WWOX基因是Ried與Bednarek等人于2000年用全基因組鳥槍法測序結(jié)合區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分離法發(fā)現(xiàn)的新抑癌基因在多種腫瘤如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等的發(fā)生有關(guān)[2-3]。本文中WWOX基因約在1/3的正常乳腺組織與2/3的乳腺癌組織表達(dá)降低或缺失，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，說明在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中WWOX基因的表達(dá)異常可能揮了重要作用。乳腺癌組織TNM分型中臨床分期與WWOX基因表達(dá)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者中WWOX表達(dá)減弱或缺失的比例38.5%、61.1%和92.9%，晚期患者WWOX的減弱或缺失表達(dá)明顯升高。結(jié)合WWOX因子在其他器官中癌癥的類似報(bào)道研究，推測抑癌基因WWOX的缺失或異常表達(dá)在乳腺癌發(fā)生和進(jìn)展中起明顯作用[4-6]。且有可能成為新的臨床判斷乳腺腫瘤的指標(biāo)，并對預(yù)后判斷可能有重要意義。

參考文獻(xiàn)

[1] Bednark A，Laflin K，Daniel R，et al.WWOX， anovel ww domain-containing protein mapping to human chromo-some 16q23.3→24.1， a region frequently affected in breastcancer[J].Cancer Res，2000，60（15）：2140-2145.

[2] Guler G，Uner A，Guler N，et al.The fragile genes FHIT and WWOX are inactivated coordinately in invasive breastcarcinoma[J].Cancer，2004，100（8）：1605-1614.

[3] Bednark A K，Keck-Waggoner C L，Daniel R L，et al.WWOX， the FRA16D gene， behaves a suppressor of tumorgrowth[J].Cancer Res，2001，61（22）：8068-8073.

[4] Nunez M I，Rosen D G，Ludes-Meyers J H，et al.WWOX protein expression varies among ovarian carcinoma histotypes and correlations with less favorable outcome[J].BMC Cancer，2005，5（1）：64-74.

[5] Kuroki T，Yendamuri S，Trapasso F，et al.The tumor suppressor gene WWOX at jFRA16D is involved in pancreatic carcinogenesis[J].Clin Cancer Res，2004，10（7）：2459-2465.

[6] Karoki T，Trapasso F，Shiraishi T，et al.Genetic alterations of the tumor suppressor gene WWOX in esophageal squamouscell carcinoma[J].Cancer Res，2002，62（8）：2258-2260.

（收稿日期：2014-05-11） （本文編輯：蔡元元）

參考文獻(xiàn)

[1] Bednark A，Laflin K，Daniel R，et al.WWOX， anovel ww domain-containing protein mapping to human chromo-some 16q23.3→24.1， a region frequently affected in breastcancer[J].Cancer Res，2000，60（15）：2140-2145.

[2] Guler G，Uner A，Guler N，et al.The fragile genes FHIT and WWOX are inactivated coordinately in invasive breastcarcinoma[J].Cancer，2004，100（8）：1605-1614.

[3] Bednark A K，Keck-Waggoner C L，Daniel R L，et al.WWOX， the FRA16D gene， behaves a suppressor of tumorgrowth[J].Cancer Res，2001，61（22）：8068-8073.

[4] Nunez M I，Rosen D G，Ludes-Meyers J H，et al.WWOX protein expression varies among ovarian carcinoma histotypes and correlations with less favorable outcome[J].BMC Cancer，2005，5（1）：64-74.

[5] Kuroki T，Yendamuri S，Trapasso F，et al.The tumor suppressor gene WWOX at jFRA16D is involved in pancreatic carcinogenesis[J].Clin Cancer Res，2004，10（7）：2459-2465.

[6] Karoki T，Trapasso F，Shiraishi T，et al.Genetic alterations of the tumor suppressor gene WWOX in esophageal squamouscell carcinoma[J].Cancer Res，2002，62（8）：2258-2260.

（收稿日期：2014-05-11） （本文編輯：蔡元元）

參考文獻(xiàn)

[1] Bednark A，Laflin K，Daniel R，et al.WWOX， anovel ww domain-containing protein mapping to human chromo-some 16q23.3→24.1， a region frequently affected in breastcancer[J].Cancer Res，2000，60（15）：2140-2145.

[2] Guler G，Uner A，Guler N，et al.The fragile genes FHIT and WWOX are inactivated coordinately in invasive breastcarcinoma[J].Cancer，2004，100（8）：1605-1614.

[3] Bednark A K，Keck-Waggoner C L，Daniel R L，et al.WWOX， the FRA16D gene， behaves a suppressor of tumorgrowth[J].Cancer Res，2001，61（22）：8068-8073.

[4] Nunez M I，Rosen D G，Ludes-Meyers J H，et al.WWOX protein expression varies among ovarian carcinoma histotypes and correlations with less favorable outcome[J].BMC Cancer，2005，5（1）：64-74.

[5] Kuroki T，Yendamuri S，Trapasso F，et al.The tumor suppressor gene WWOX at jFRA16D is involved in pancreatic carcinogenesis[J].Clin Cancer Res，2004，10（7）：2459-2465.

[6] Karoki T，Trapasso F，Shiraishi T，et al.Genetic alterations of the tumor suppressor gene WWOX in esophageal squamouscell carcinoma[J].Cancer Res，2002，62（8）：2258-2260.

（收稿日期：2014-05-11） （本文編輯：蔡元元）