徐琳 鄒婷

摘 要：目的 用薄膜過濾法和平板傾注法對無酒精口腔洗劑一類的醫(yī)療用品進行初始污染菌檢測，選擇適合此類產(chǎn)品的檢測方法。方法 采用ISO 11737-1： 2006醫(yī)療器械的滅菌-微生物方法-第一部分：產(chǎn)品上微生物總數(shù)的估計，對供試品進行初始污染菌檢測試驗。結(jié)果 用薄膜過濾法對無酒精口腔洗劑進行檢測，總平均菌落數(shù)是8cfu/件；用平板傾注法對無酒精口腔洗劑進行檢測，總平均菌落數(shù)是1800cfu/件。結(jié)論 對無酒精口腔洗劑此類產(chǎn)品檢測時，宜采用薄膜過濾法。

關(guān)鍵詞：薄膜過濾法；平板傾注法

隨著近幾年來經(jīng)濟發(fā)展迅猛，科技進步加快，人們的生活水平提高，對醫(yī)療衛(wèi)生用品的需求也越來越多，企業(yè)也根據(jù)人們的需求生產(chǎn)出了一系列產(chǎn)品。這就需要檢驗人員根據(jù)不同的產(chǎn)品制定合適的檢測方案。本文就無酒精口腔洗劑，采用薄膜過濾法和平板傾注法對其初始污染菌檢測進行探討。

一、材料與試劑

（一）試驗材料。試驗樣品為某公司生產(chǎn)的無酒精口腔洗劑，400ml/瓶，綠色。

（二）試驗菌種。大腸埃希菌〔CMCC（B）44102〕第三代；金黃色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕第三代；枯草芽孢桿菌〔CMCC

（B）63 501〕第三代；白色念珠菌〔CMCC（F）98 001〕第三代；黑曲霉〔CMCC（F） 98 003〕第四代；均購買自中科院微生物研究所。

（三）試劑。0.9%NaCl溶液（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）（中國腹瀉病控制上海試劑供應(yīng)研究中心）；虎紅培養(yǎng)基（RBA）（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；大豆酪蛋白消化物肉湯培養(yǎng)基（SCDB）（中國腹瀉病控制上海試劑供應(yīng)研究中心）。

（四）儀器。高壓滅菌器；生化培養(yǎng)箱；超凈工作臺；生物安全柜。

二、試驗方法

（一）平板傾注法方法驗證。（1）菌懸液制備 用0.9%無菌氯化鈉溶液將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物制備成50-100 cfu/ml的菌懸液備用，用含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物制備成50-100 cfu/ml的孢子懸液備用。（2）試驗組 取樣品原液2 ml，分別接種于2個平板，每平板1 ml，同時每平板加入1 ml菌懸液，每平板注入15-20 ml培養(yǎng)基后培養(yǎng)；（3）菌液組 取菌懸液2 ml，分別接種于2個平板，每平板1 m，每平板注入15-20 ml培養(yǎng)基后培養(yǎng)。（4）樣品對照組 取樣品原液2 ml，分別接種于2個平板，每平板1 m，每平板注入15-20

ml培養(yǎng)基后培養(yǎng)。（5）進行三次獨立的平行試驗。（6）平均回收率。平均回收率（%）=×100%。（7）判斷標(biāo)準(zhǔn)平均回收率≥70%。（8）結(jié)果。（9）結(jié)論 平均回收率≥70%，可以在此條件下進行細菌、霉菌計數(shù)。

（二）平板傾注法。（1）洗脫液 0.9%NaCl溶液。（2）樣品處理 以無菌操作轉(zhuǎn)移試驗樣品（SIP=1ml）至10ml洗脫液中，于旋渦混合器（2800轉(zhuǎn)/分鐘）中振蕩2min備用。（3）細菌培養(yǎng) 產(chǎn)品洗脫液2ml，分別接種于2個平板，每平板1ml。每平板注入20ml TSA，30-35℃培養(yǎng)3-7天。（4）霉菌培養(yǎng) 產(chǎn)品洗脫液

2ml，分別接種于2個平板， 每平板1ml。每平板注入20ml RBA，20-25℃培養(yǎng)5-7天。（5）計數(shù) 按菌落計數(shù)原則進行計數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，計算出每件產(chǎn)品的菌落數(shù)（cfu/件）。

（三）薄膜過濾法方法驗證。（1）菌懸液制備 用0.9%無菌氯化鈉溶液將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物制備成50-100 cfu/ml的菌懸液備用，用含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物制備成50-100 cfu/ml的孢子懸液備用。（2）試驗組 取無酒精口腔洗劑100ml，同時加入1 ml菌懸液，過濾后，將膜放在瓊脂平皿上，30-35℃培養(yǎng)3-7天。（3）菌液組 取菌懸液2 ml，分別接種于2個平板，每平板1 m，每平板注入15-20

ml培養(yǎng)基后培養(yǎng)。（4）樣品對照組 過濾100ml的無酒精口腔洗劑，將膜放在瓊脂平皿上，30-35℃培養(yǎng)3-7天。（5）進行三次獨立的平行試驗。

三、結(jié)果

表1 薄膜過濾法檢測結(jié)果

表2 平板傾注法檢測結(jié)果

四、討論

由以上兩表得知，用薄膜過濾法對無酒精口腔洗劑進行檢測，總平均菌落數(shù)是8cfu/件；用平板傾注法對無酒精口腔洗劑進行檢測，總平均菌落數(shù)是1800cfu/件。如果以此結(jié)果來作為生產(chǎn)過程的常規(guī)控制，或以此來為了確立滅菌過程的處理程度，兩者結(jié)果相比，平板傾注法會產(chǎn)生較大的誤差，會給企業(yè)的分析帶來誤導(dǎo)，會給后續(xù)的判斷帶來一系列的誤差。

平板傾注法是直接吸取洗脫液，傾注培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，試驗簡單易操作，但對于含菌數(shù)少的產(chǎn)品來說，用此類的方法進行試驗，容易漏檢。洗脫時產(chǎn)品上殘留的微生物越多，對后續(xù)產(chǎn)品滅菌后殘留微生物的概率就相對比較大，因此，這樣方法對微生物集中水平較低的洗脫液的敏感度較差。

薄膜過濾法是將適當(dāng)孔徑的濾膜放入過濾器，過濾樣品洗脫液，由于濾膜的作用將微生物保留在膜的表面上。然后，將濾膜放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。采用膜過濾法進行微生物檢測是一種國際公認的微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法，廣泛應(yīng)用于環(huán)境檢測、化妝品、制藥工業(yè)品質(zhì)控制等領(lǐng)域。與平板傾注法比，濃縮效應(yīng)使微生物檢測的準(zhǔn)確度提高，不僅對于液體制劑這樣的產(chǎn)品適用，對于大件無法切割的產(chǎn)品也同樣被采納。

參考文獻：

[1] Sterilization of Medical Devices-Microbiological Method-Part 1：Determination of a Population of Microorganisms on Products， ISO11737-1：2006.

[2] 中國藥典2010第二部附錄XI J微生物限度檢查法.