冷瀟，周艷，唐海明，張祥，劉佳，楊佩，王衍堂＊

（1.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，成都 610083；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，成都 610041）

伴隨動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)的飛速發(fā)展，基因敲除動(dòng)物已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域極為重要的工具之一［1］。由于小鼠與人類遺傳基因高達(dá)85%的同源性，小鼠成為除人類以外的第二個(gè)完成全基因組測(cè)序的哺乳動(dòng)物。同時(shí)，大量的基因敲除小鼠品系已建立，并應(yīng)用于基因功能研究［2］。但因?yàn)檎w敲除動(dòng)物易發(fā)生胚胎致死突變，以及基因在多個(gè)器官系統(tǒng)敲除后，出現(xiàn)生物學(xué)功能的相互干擾，影響基因敲除效應(yīng)分析的準(zhǔn)確性等問(wèn)題，對(duì)敲除動(dòng)物在基因功能研究中的深入應(yīng)用產(chǎn)生了相當(dāng)?shù)睦_。條件性基因敲除技術(shù)的出現(xiàn)完美地規(guī)避了以上問(wèn)題，其通過(guò)將某種細(xì)胞特異性表達(dá)重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠和靶基因鉗制小鼠雜交，得到在該種特定類型的細(xì)胞靶基因特異性敲除且敲除階段完全可控的轉(zhuǎn)基因小鼠，從而為靶基因在特異組織或器官的功能研究提供了一個(gè)極為優(yōu)秀的平臺(tái)［3，4］。

本課題組研究的目標(biāo)基因Perp，在外周T淋巴細(xì)胞發(fā)育以及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中均起著重要作用。但Perp全身敲除的純合子小鼠因?yàn)槠つw上皮細(xì)胞橋粒功能的缺陷，極易自發(fā)廣泛且嚴(yán)重的表皮內(nèi)松解性大皰，極少能存活至成年期，在出生2w內(nèi)即出現(xiàn)大量死亡［5，6］。因此，筆者從美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)了Perp基因條件敲除鼠（conditional knock out mic，cKO mice）以及 Lck－Cre轉(zhuǎn)基因小鼠［7］，借助Cre-LoxP位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)，構(gòu)建Perp基因在免疫系統(tǒng)中特異性敲除的工具小鼠，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步在整體動(dòng)物水平研究Perp基因在T細(xì)胞發(fā)育以及在自身免疫疾病發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物PerpcKO雜合子型（Perpfl/＋）小鼠及Lck-Cre雜合子小鼠均購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室。小鼠引進(jìn)后在成都醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房進(jìn)行實(shí)驗(yàn)與繁殖。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 基因組DNA提取純化試劑盒（Wizard）；PCR試劑盒（Fermentas）；熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa）；兔抗鼠Perp多克隆抗體（Santa Cruz）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Perp條件基因敲除小鼠的建立 由于引進(jìn)的Perp條件敲除小鼠均為雜合子，所以采用1只雄鼠與1只雌鼠進(jìn)行合籠繁殖，其F1子代小鼠可能出現(xiàn)野生型（Perp＋/＋）、雜合子（Perpfl/＋）和純合子（Perpfl/fl）3種表型。故需應(yīng)用PCR以及電泳法在子代3～4w時(shí)進(jìn)行Perp基因loxp位點(diǎn)的鑒定。將鑒定為純合子（Perpfl/fl）的F1代小鼠繼續(xù)采用1只雄鼠與1只雌鼠進(jìn)行合籠繁殖，F(xiàn)2代小鼠則只會(huì)出現(xiàn)純合子（Perpfl/fl）表型。繼續(xù)將Perpfl/fl純合子小鼠與Lck-Cre雜合子小鼠雌雄合籠，應(yīng)用PCR以及電泳法進(jìn)行Perp基因loxp位點(diǎn)以及表達(dá)Cre重組酶的鑒定，篩選得到Perpfl/＋×LckCre/＋小鼠，即為實(shí)驗(yàn)需要的Perp基因T淋巴細(xì)胞特異性敲除小鼠。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及水平電泳 PCR反應(yīng)引物由上海生工合成，引物序列見(jiàn)表1。采用PCR擴(kuò)增儀（ABI）進(jìn)行Perptm2Att序列和Generic Cre序列的循環(huán)擴(kuò)增，設(shè)置的反應(yīng)條件分別見(jiàn)表2、表3。取PCR反應(yīng)終產(chǎn)物3μL在1%瓊脂糖凝膠電泳，DL2000作為DNA分子量標(biāo)記物，10V/cm進(jìn)行電泳，全自動(dòng)凝膠圖像系統(tǒng)（Bio-rad）分析成像并保存。

表1 PCR反應(yīng)引物序列

表2 Perptm2Att序列的PCR反應(yīng)條件

表3 Generic Cre序列的PCR反應(yīng)條件

1.2.3 qPCR以及Western Blot檢測(cè)Perp表達(dá)水平 脫臼處死小鼠，取出脾臟，制備脾細(xì)胞懸液。注入尼龍毛柱（日本和光公司），37℃，5%CO2孵箱孵育1h，得到純化的T細(xì)胞。應(yīng)用Trizol法抽提細(xì)胞RNA，以此為模板，借助逆轉(zhuǎn)PCR試劑盒（TAKARA），通過(guò)PCR反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)Perp基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)引物序列：Perpforward，5｀-GACCCCAGATGCTTGTTTTC-3｀；Perpreverse，5｀-ACCAG-GGAGAT GATC TGGAA-3｀。應(yīng)用 qPCR 試劑盒 （TAKARA），在Real-time PCR儀（Bio-rad）上分析Perp基因在脾臟T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)水平。

應(yīng)用細(xì)胞裂解及蛋白抽提試劑盒（碧云天）從脾臟T細(xì)胞中提取總蛋白，BCA法（Termo）測(cè)定蛋白濃度后，應(yīng)用Western Blot法測(cè)定在脾臟T淋巴細(xì)胞中Perp蛋白的表達(dá)水平。全自動(dòng)凝膠圖像系統(tǒng)（Bio-rad）分析成像并保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Perpflox小鼠的繁殖、生長(zhǎng)及鑒定

Perpflox雜合子小鼠雌雄合籠繁殖出F1子代小鼠，子代小鼠基因型鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。篩選出的F1代Perpflox純合子小鼠，繼續(xù)雌雄合籠繁殖出F2子代小鼠，經(jīng)鑒定全部為Perpflox純合子小鼠。

圖1 Perpflox小鼠基因型的鑒定結(jié)果

2.2 表達(dá)Cre重組酶小鼠的繁殖、生長(zhǎng)及鑒定

T淋巴細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶的小鼠與Perpflox純合子小鼠雌雄合籠繁殖。對(duì)F1代小鼠進(jìn)行基因型鑒定，篩選得到表型為L(zhǎng)ck-Cre×Perpfl/＋的雜合子小鼠。將Lck-Cre×Perpfl/＋的雜合子小鼠繼續(xù)雌雄合籠繁殖。對(duì)F2代小鼠進(jìn)行基因型鑒定，篩選得到表型為 Lck-Cre×Perpfl/fl的Cre重組酶陽(yáng)性的純合子小鼠即為實(shí)驗(yàn)需要的小鼠基因型。部分小鼠的鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 Lck-Cre×Perpflox/flox小鼠脾臟T細(xì)胞中Perp的表達(dá)水平

應(yīng)用熒光定量PCR及Western Blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Lck-Cre×Perpflox/flox小鼠脾臟T細(xì)胞的Perp基因的RNA及蛋白表達(dá)水平與Lck-Cre×Perp＋/＋小鼠相比顯著降低（見(jiàn)圖3）。

3 討論

條件性基因敲除（conditional knockout）是將某個(gè)基因在生物特定類型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段靜默的基因打靶方法，是在常規(guī)基因敲除的基礎(chǔ)上，利用重組酶介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組技術(shù)，在生物基因敲除的范圍和時(shí)間上均處于一種可控狀態(tài)。借助這一新型的條件打靶技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了基因在時(shí)間和空間上特異性敲除的效果，從而可以避免關(guān)鍵基因在完全性敲除（complete knockout）后的胚胎致死以及發(fā)育缺陷等問(wèn)題［8，9］。條件性基因敲除的實(shí)現(xiàn)則主要依賴Cre-LoxP和FLP-frt重組系統(tǒng)，這兩個(gè)系統(tǒng)是真核細(xì)胞內(nèi)染色體位點(diǎn)特異性重組酶的同源系統(tǒng)。其主要原理為在待敲除的一段目標(biāo)DNA序列的兩端各放置一個(gè)loxP（或Frt）序列，得到flox（flanked by loxP）小鼠。將flox小鼠與帶有細(xì)胞特異性表達(dá)的Cre（或Flp）的小鼠交配繁殖，以獲得在特定細(xì)胞里把目標(biāo)基因敲除掉的小鼠，即條件性基因敲除小鼠［10］。與 FLP/frt重組系統(tǒng)相比，Cre/LoxP重組系統(tǒng)在構(gòu)建條件性基因敲除小鼠的應(yīng)用中更為廣泛，主要有以下原因：1）Cre酶的活性較Flip酶更高，且Cre酶的最適反應(yīng)溫度在37℃左右，與哺乳動(dòng)物的體溫非常接近，而Flip酶的最適溫度是30℃，優(yōu)化后的活性依然不如Cre酶。2）Cre-LoxP系統(tǒng)經(jīng)過(guò)20多年的發(fā)展和應(yīng)用，尤其在免疫學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)研發(fā)了大量的Cre酶工具鼠，以至于目前絕大部分應(yīng)用于條件敲除的工具鼠都是Cre酶工具鼠，因此借助Cre-LoxP系統(tǒng)可以將flox小鼠與更多的工具鼠交配，將極大地拓展筆者研究的廣度［11，12］。

圖2 表達(dá)Cre重組酶的小鼠基因型的鑒定結(jié)果

本課題組研究的目標(biāo)基因Perp位于6號(hào)染色體6q24區(qū)域。由于Perp基因是凋亡調(diào)控中的關(guān)鍵基因，與上皮細(xì)胞橋粒功能以及皮膚腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。因此，Perp基因的完全性敲除小鼠在幼年期病死率極高，難以進(jìn)行該基因功能的相關(guān)性研究。本課題組通過(guò)引進(jìn)Perp基因條件敲除鼠以及Lck-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠，利用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)，構(gòu)建Perp基因在免疫系統(tǒng)中特異性敲除的工具小鼠，并借助PCR擴(kuò)增以及瓊脂糖電泳法對(duì)Perpflox小鼠和表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行基因型鑒定，保證了應(yīng)用Cre-LoxP系統(tǒng)進(jìn)行條件敲除前的flox小鼠和Cre小鼠是預(yù)想的基因型背景（見(jiàn)圖1、2）。在構(gòu)建完成 Lck-Cre×Perpfl/fl的條件敲除小鼠后，進(jìn)一步應(yīng)用熒光定量PCR反應(yīng)和western blot法驗(yàn)證了小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞中Perp基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平（見(jiàn)圖3），證實(shí)在Perp基因條件敲除后，在目標(biāo)類型的細(xì)胞上靜默效果完全符合預(yù)期。

圖3 Lck-Cre×Perpflox/flox小鼠脾臟T細(xì)胞中Perp的表達(dá)分析

綜上所述，Lck-Cre×Perpfl/fl的條件敲除小鼠成功構(gòu)建，將有利于我們?cè)谡w動(dòng)物水平研究Perp基因在T細(xì)胞發(fā)育以及在自身免疫疾病發(fā)病中的作用。

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