王兵

葡萄膜炎病因復雜，類型繁多，主要累及葡萄膜、視網(wǎng)膜血管、視網(wǎng)膜及玻璃體等組織，占致盲眼病的第3～7位[1]，葡萄膜炎病程較長，主要發(fā)生于青壯年，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，危害性很大[2]，環(huán)磷酰胺對CD4淋巴細胞有明顯抑制作用，并通過抑制體液免疫降低了外周淋巴細胞IL-17的表達[3]從而起到治療葡萄膜炎的作用。本研究通過對比分析環(huán)磷酰胺治療EAU的資料，來探討環(huán)磷酰胺對EAU治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取SPF級雄性動物Lewis大鼠54只,周齡6～8周，體重150～180g(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供)。所有動物均按照視覺與眼科學研究協(xié)會中關(guān)于使用動物進行眼科與視覺研究的要求進行飼養(yǎng)和處理。使用過程中遵循天津市科學技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》。

1.2 主要試劑和儀器 牛S抗原，蘇木精液；PH7.4，0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)；聚合HRP標記羊抗兔IgG、DAB；弗氏完全佐劑(complete Freund adjuvant， CFA)；白喉-破傷風-百日咳菌苗；規(guī)格為1.5ml Eppendorf管；裂隙燈顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympic公司BX51型400倍光學顯微鏡)；電腦全自動組織脫水機；濃度20g/L環(huán)磷酰胺液。

1.3 方法

1.3.1 誘導劑的配置 誘導劑的配置：取15mg牛S抗原溶解于15ml PBS緩沖液中，過濾、除菌，抽取等量濃度為lmg/ml的牛S抗原溶液與弗氏完全佐劑混勻乳化?；靹?h后，將乳化成功的溶液放置于冰塊上，待用。

1.3.2 EAU模型制作和分組 采用隨機數(shù)字法將所有大鼠隨機分為實驗組和正常對照組，其中實驗組大鼠48只，正常對照組6只。實驗組：取30μg制備好的誘導液，在大鼠雙后足墊皮內(nèi)注射，同時腹腔內(nèi)注射白喉-破傷風-百日咳菌苗0.1ml。正常對照組：在大鼠雙后足墊皮內(nèi)注射等量的生理鹽水。造模3d后每天裂隙燈顯微鏡下觀察大鼠眼內(nèi)炎癥反應情況，判斷造模是否成功。

1.3.3 環(huán)磷酰胺治療 采用隨機數(shù)字法將實驗組大鼠隨機平均分為環(huán)磷酰胺組和空白對照組，各24只。環(huán)磷酰胺組：大鼠于造模成功后每天相同時間點，在大鼠尾靜脈注射1ml環(huán)磷酰胺(20g/L)，連續(xù)注射3d；空白對照組：大鼠于造模成功后每天相同時間點，在大鼠尾靜脈注射1ml生理鹽水，連續(xù)注射3d，根據(jù)Caspi[4]臨床分級進行評分。

1.4 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行處理，眼內(nèi)炎癥反應臨床分級評分以中位數(shù)和四分位數(shù)表示，采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗進行統(tǒng)計學比較。其余數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示，采用單因素方差分析和兩隨機樣本的t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠眼前節(jié)裂隙燈顯微鏡觀察炎癥反應情況和Caspi臨床分級評分 正常對照組：發(fā)現(xiàn)房水清、虹膜紋理清晰、瞳孔圓、對光反射良好，未見明顯異常；其Caspi臨床分級評分均為0級。

空白對照組：造模后6天開始出現(xiàn)EAU炎癥癥狀，此時觀察到主要的炎癥表現(xiàn)為房水閃輝、晶狀體前囊灰白色點狀沉著物、虹膜血管輕度充血、擴張等；造模后9天 EAU炎癥癥狀加重，主要的炎癥表現(xiàn)為房水閃輝加重，瞳孔對光反射消失、瞳孔縮小等；造模后12天 EAU炎癥癥狀最嚴重，主要的炎癥表現(xiàn)為前房變淺甚至消失、瞳孔發(fā)生閉鎖、前房積膿，能擴大瞳孔者可見玻璃體內(nèi)密集的團狀混濁；造模后第15天 EAU炎癥癥狀有所減輕；造模后第18天炎癥癥狀明顯減輕。

環(huán)磷酰胺組：造模后第8天開始出現(xiàn)EAU炎癥癥狀，隨后炎癥反應逐漸加重，至造模后第12天最重，其后逐漸減輕，造模后第18天 EAU炎癥癥狀明顯減輕，但各時間點的嚴重程度明顯低于空白對照組。

2.2 空白對照組和環(huán)磷酰胺組不同時間點大鼠Caspi臨床分級評分比較 見表1。環(huán)磷酰胺組造模后第6、9、12和18天大鼠眼內(nèi)炎癥反應Caspi臨床分級評分均顯著低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而正常對照組Caspi臨床分級評分均為0級。

表1 兩組不同時間點大鼠Caspi臨床分級評分比較

3 討論

本實驗提示牛S-Ag和CFA等量混合可成功誘導Lewis大鼠成功制造EAU模型。其機制可能為牛S-Ag和CFA等量混合抗原可誘導反應性T細胞大量增殖為Thl或Thl7細胞，這些激活的效應T細胞隨血流到達眼內(nèi)組織，識別與其同源的抗原，并激活下游信號，導致血眼屏障的破壞，炎癥細胞的浸潤繼而炎癥發(fā)展為葡萄膜炎[5]。

大鼠眼前節(jié)裂隙燈顯微鏡下觀察，空白對照組免疫第6d開始出現(xiàn)EAU炎癥癥狀、12天 EAU炎癥癥狀最嚴重、造模后15天 EAU炎癥癥狀有所減輕、造模后第18天 EAU炎癥癥狀明顯減輕。環(huán)磷酰胺組造模后第8天開始出現(xiàn)EAU炎癥癥狀，隨后炎癥反應逐漸加重，至造模后12天最重，其后逐漸減輕，造模后第18天 EAU炎癥癥狀明顯減輕，但各時間點的嚴重程度明顯低于空白對照組。說明造模成功后12天 EAU病情最嚴重，眼內(nèi)炎癥反應達到最高峰。隨時間推移兩組都在18天趨向好轉(zhuǎn)，說明EAU具有自限性，印證了葡萄膜炎是自身免疫性疾病這一觀點。在不同時間點環(huán)磷酰胺組的炎癥反應及均低于空白對照組，說明環(huán)磷酰胺能抑制EAU反應過程中炎性介質(zhì)的釋放。其機制可能為抑制CD4+細胞亞群CD17細胞的細胞因子IL-17的表達，抑制了葡萄膜炎的發(fā)生、發(fā)展[6]。

環(huán)磷酰胺是一種烷化劑，是應用最廣的氮芥類衍生物，代謝在肝臟進行，其不良反應主要為肝功能、腎功能損壞、出血性膀胱炎、血細胞異常等，臨床上多用于抗腫瘤治療。

研究表明，環(huán)磷酰胺對CD4淋巴細胞有明顯抑制作用[7]，并通過抑制體液免疫降低了外周淋巴細胞的表達，可以治療非感染性和多種類型的難治性葡萄膜炎，主要用于糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑無反應的頑固性眼病患者[8]，本研究選取環(huán)磷酰胺，考慮其能通到免疫學機制影響葡萄膜炎的進程，減輕大鼠葡萄膜炎病變程度，改善葡萄膜炎病情。其原因可能為環(huán)磷酰胺通過與DNA鳥嘌呤的第七位氮發(fā)生持久的交叉打結(jié)，導致DNA編碼錯誤，使細胞的DNA在分裂過程中不能分裂，最終導致細胞死亡[9]。

總之，雖然環(huán)磷酰胺能夠減輕大鼠葡萄膜炎病變程度，改善葡萄膜炎病情，為我們治療葡萄膜炎提供了新的治療方法。

[1]何躍，呂紅彬，張熙伯，等.環(huán)磷酰胺筋膜下注射聯(lián)合糖皮質(zhì)激素治療葡萄膜炎[J].國際眼科雜志，2007，7(6)：1725-1726.

[2]李光達，張曉敏，袁立飛，等.雷帕霉素對大鼠實驗性自身免疫性葡萄膜炎的治療作用[J].中華實驗眼科雜志，2011，29(11)：973-977.

[3]袁立飛，張曉敏，李光速，等.間充質(zhì)干細胞對大鼠實驗性自身免疫性葡萄膜炎視網(wǎng)膜中白細胞介素17表達的影響[J].中華實驗眼科雜志，2012，30(5)：392-396.

[4]Caspi RR.Thl and Th2 responses in pathogenesis and regulation of experimentaI autoimmune uveoretinitis[J].1nt Rev Immun01,2002,21(23):197-208.

[5]唐搖紅，蔡莉萍，張愉.調(diào)節(jié)T細胞與葡萄膜炎的研究進展[J].國際眼科雜志，2011，11(3)：450-452.

[6]徐曉芳，呂嘉華.酪氨酸酶相關(guān)蛋白誘導實驗性自身免疫性葡萄膜炎的臨床和病理特點[J].中華眼科雜志，2008，24(5)：373-377.

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[8]周增超，王紅，彭曉燕，等.細胞因子信號抑制因子在實驗性自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎外周血單個核細胞內(nèi)的表達變化[J].中華眼科雜志，2008，24(5)：340-344.

[9]梁亮，王紅，彭曉燕，等.IL-17在實驗性自身免疫性葡萄膜炎大鼠模型眼部的表達[J].眼科研究，2010，28(4)：315-318.