經(jīng)語佳 高 健 鄭亞洲 王夢芝

(揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

反芻動物瘤胃對養(yǎng)分的消化吸收以及微生物發(fā)酵可產(chǎn)生大量的揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，而VFA對反芻動物營養(yǎng)代謝和其瘤胃功能存在著重要的影響，且不同種類VFA對反芻動物生理作用不同，飼糧中添加脂肪酸可以影響瘤胃微生物區(qū)系及其發(fā)酵的過程，引起VFA濃度及比例的變化。VFA是有機(jī)物質(zhì)在瘤胃中發(fā)酵的主要產(chǎn)物，可以為反芻動物提供70% ～80%的可消化能［1-2］，并且通過VFA代謝為瘤胃消化吸收提供大部分能量［3］。同時，VFA的產(chǎn)生可以使瘤胃保持一個較為理想的酸性環(huán)境，利于瘤胃微生物的生長與繁殖，再通過瘤胃微生物對飼糧進(jìn)行發(fā)酵，從而形成瘤胃環(huán)境的良性循環(huán)［4］。另外，VFA作為結(jié)腸厭氧菌對飼糧纖維、未消化淀粉等物質(zhì)降解、酵解的終產(chǎn)物，易被結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞吸收，為結(jié)腸黏膜提供能源，具有刺激結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖和黏膜生長、增加腸系膜血流和胃腸激素分泌等生理作用。由此可見，VFA在改善反芻動物生產(chǎn)性能中有重要意義。研究表明，油脂在瘤胃中降解產(chǎn)生的不飽和鍵能抑制原蟲［5］、部分菌群［6］的生長及原蟲對細(xì)菌的吞噬［7］，進(jìn)而可能通過改變瘤胃微生物的群體結(jié)構(gòu)而影響瘤胃的發(fā)酵。Ramesh等［8］也報道不同脂肪酸對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸和丙酸濃度的影響具有一定的差異。但目前對于脂肪酸影響瘤胃內(nèi)環(huán)境及特定微生物區(qū)系等的研究鮮見報道。為此，本研究選取6種不同種類的長鏈脂肪酸，旨在研究其對瘤胃微生物體外發(fā)酵產(chǎn)生的VFA濃度的影響，并且為進(jìn)一步研究脂肪酸對反芻動物瘤胃微生態(tài)機(jī)理的影響提供試驗(yàn)參考和部分理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在2013年3月至2013年5月期間進(jìn)行。在揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)農(nóng)牧場選取3頭1.5周歲、體重(29.4±2.7)kg、裝有永久性瘤胃瘺管的山羊，單圈飼養(yǎng)，以玉米+豆粕+羊草為常規(guī)飼糧，每日按體重的2.5%干物質(zhì)量供料，07:00和19:00分2次等量飼喂，自由飲水。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計與培養(yǎng)底物

試驗(yàn)分為添加3%硬脂酸(A組)、油酸(B組)、亞油酸(C組)、α-亞麻酸(D組)、花生四烯酸(E組)、二十碳五烯酸(F組)的試驗(yàn)組和添加3%棕櫚酸鈣的對照組，每組各設(shè)3個重復(fù)，另外設(shè)1個無底物的空白對照。培養(yǎng)底物組成見表1。

表1 培養(yǎng)底物組成Table 1 Composition of culture substrates %

1.3 體外培養(yǎng)與樣品采集

1.3.1 瘤胃液的采集

通過瘤胃瘺管，利用自制真空負(fù)壓裝置，在晨飼前從3只瘺管羊的瘤胃中各采集瘤胃液500 mL，過4層紗布，濾液裝于事先通有CO2并39℃預(yù)熱的滅菌生理鹽水瓶中，將3只羊瘤胃液混合均勻，39℃水浴保溫迅速送回實(shí)驗(yàn)室。

1.3.2 體外培養(yǎng)

體外培養(yǎng)參照Menke等［9］的方法。配制培養(yǎng)液(人工唾液鹽∶瘤胃液 =2∶1)，通入 CO2，39 ℃水浴預(yù)熱。按照試驗(yàn)設(shè)計編號三角瓶并滅菌30 min，并準(zhǔn)確稱取各組1.95 g底物置于培養(yǎng)瓶中，分別加入200 mL培養(yǎng)液。通入CO2，39℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng)。

分別在培養(yǎng)后 0、3、6、9、12、18、24 h 取樣，每次取2 mL，并-20℃冷凍保存，用于培養(yǎng)液VFA濃度的測定。

1.4 培養(yǎng)液VFA濃度測定

采用日本島津GC-14B氣相色譜儀參考文獻(xiàn)［10］的方法進(jìn)行測定。測定條件:毛細(xì)管柱CP-WAX(長30 m，內(nèi)徑0.53 mm，膜厚1μm);氣化室溫度200℃，氫火焰離子化檢測器(FID)溫度200℃;柱溫采用程序升溫法，初溫100℃，末溫150℃，升溫速率3℃/min，靈敏度為101，衰減為25，以巴豆酸為內(nèi)標(biāo)物。培養(yǎng)液處理:培養(yǎng)液經(jīng)15 000×g離心10 min后取上清液1 mL加0.2 mL 20%含60 mmol/L巴豆酸的偏磷酸，混勻后高速離心取上清液0.4μL進(jìn)樣分析。

1.5 統(tǒng)計分析

用SPSS v16.0軟件中compare mean的oneway ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 不同種類長鏈脂肪酸對總VFA濃度的影響

由表2可知，各組總VFA濃度總體上都呈現(xiàn)上升趨勢，其時間點(diǎn)平均值由0 h的38.97 mmol/L上升至24 h的117.03 mmol/L，并以D組在培養(yǎng)時間內(nèi)持續(xù)在較高水平波動，而對照組在相對較低的水平波動?？俈FA濃度平均值D組最高，為 91.24 mmol/L;對照組最低，為78.47 mmol/L。

0、9、12、24 h 時，總 VFA 濃度組間差異不顯著(P＞0.05);3 h時，D組總VFA濃度顯著高于A、B、C和對照組(P＜0.05)，但與 E和 F組間差異不顯著(P＞0.05);6 h時，D組總VFA濃度顯著高于A組和對照組(P＜0.05)，但與B、C、E、F組間差異不顯著(P＞0.05);18 h時，D組總VFA濃度顯著高于A、B、E、F組和對照組(P＜0.05)，但與C組間差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 不同種類長鏈脂肪酸對乙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比的影響

由表3可知，乙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比總體上呈現(xiàn)下降的趨勢，在培養(yǎng)后期有上升的趨勢，數(shù)值在62.87% ～69.74%間變動。

表2 不同種類長鏈脂肪酸對總VFA濃度的影響Table 2 Effects of different kinds of long-chain fatty acids on total VFA concentration mmol/L

0、3、6、12、24 h 時，乙酸在總 VFA 中的摩爾濃度百分比組間差異皆不顯著(P＞0.05);9 h時，D組乙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比顯著高于B和F組(P＜0.05)，但與A、C、E組和對照組間差異不顯著(P＞0.05);18 h時，D組乙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比顯著高于F組(P＜0.05)，但與A、B、C、E組和對照組間差異不顯著(P＞0.05)。

2.3 不同種類長鏈脂肪酸對丙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比的影響

由表4可知，丙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比總體上呈現(xiàn)上升、下降、再上升和再下降的波動變化趨勢，數(shù)值在20.86% ～25.83%間變動。

在各采樣時間點(diǎn)，丙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比組間差異皆不顯著(P＞0.05)。

表3 不同種類長鏈脂肪酸對乙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比的影響Table 3 Effects of different kinds of long-chain fatty acids on acetate molar concentration percentage in total VFA %

表4 不同種類長鏈脂肪酸對丙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比的影響Table 4 Effects of different kinds of long-chain fatty acids on propionate molar concentration percentage in total VFA %

2.4 不同種類長鏈脂肪酸對乙酸/丙酸的影響

由表5可知，乙酸/丙酸總體上呈現(xiàn)下降、上升、再下降和再上升的波動變化趨勢，數(shù)值在2.48～3.34間變動。試驗(yàn)各組乙酸/丙酸平均值以A、D組及對照組較高。0 h平均值較高，為3.19，培養(yǎng)3 h后下降為2.67，之后在2.66～2.79間變動。

6 h時，A組和對照組乙酸/丙酸顯著高于B和C組(P＜0.05)，其他組間差異不顯著(P＞0.05);其他時間點(diǎn)，乙酸/丙酸組間差異皆不顯著(P＞0.05)。

2.5 不同種類長鏈脂肪酸對丁酸在總VFA中的摩爾濃度百分比的影響

由表6可知，丁酸在總VFA中的摩爾濃度百分比總體上呈現(xiàn)下降、上升再下降的趨勢，數(shù)值在7.62%～13.08%間變動。

0、12、24 h時，丁酸在總VFA中的摩爾濃度百分比組間差異皆不顯著(P＞0.05);3和6 h時，D組丁酸在總VFA中的摩爾濃度百分比顯著低于A組(P＜0.05)，但與其他組間差異皆不顯著(P＞0.05);9 h時，D組丁酸在總VFA中的摩爾濃度百分比顯著低于B組(P＜0.05)，但與其他組間差異皆不顯著(P＞0.05);18 h時，D組丁酸在總VFA中的摩爾濃度百分比顯著低于F組和對照組(P＜0.05)，但與其他組間差異皆不顯著(P＞0.05)。

表5 不同種類長鏈脂肪酸對乙酸/丙酸的影響Table 5 Effects of different kinds of long-chain fatty acids on acetate/propionate

表6 不同種類長鏈脂肪酸對丁酸在總VFA中的摩爾濃度百分比的影響Table 6 Effects of different kinds of long-chain fatty acids on butyrate molar concentration percentage in total VFA%

3 討論

3.1 不同種類長鏈脂肪酸對總VFA濃度的影響

本研究結(jié)果表明，添加不同種類的長鏈脂肪酸后，培養(yǎng)液中總VFA濃度均呈現(xiàn)上升趨勢，且0～6 h之間總VFA濃度增長速度較快，6 h后增長速度減緩，這可能與瘤胃微生物的活性有關(guān)，符合微生物的生長繁殖規(guī)律，即微生物在指數(shù)生長期之后，生長速度趨于平穩(wěn)，然后進(jìn)入衰亡期［11-12］。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組總VFA濃度均高于對照組，其中以α-亞麻酸組持續(xù)在較高的水平(平均值為91.24 mmol/L)波動，且在部分時間點(diǎn)與其他組間有顯著差異，說明3%水平的α-亞麻酸有較好地促進(jìn)發(fā)酵的效應(yīng)。這可能由于游離脂肪酸中的不飽和鍵能抑制瘤胃原蟲的生長繁殖［13］，并抑制原蟲對瘤胃細(xì)菌的吞噬，從而提高了微生物的生物總量和其群體的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而促進(jìn)了瘤胃的發(fā)酵。而不同組間發(fā)酵效果的差異，可能和游離脂肪酸的不飽和程度有關(guān)。本試驗(yàn)添加3%的油酸、亞油酸、α-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸，相當(dāng)于在培養(yǎng)體系中分別添加了相應(yīng)的脂肪酸 0.212、0.214、0.216、0.198、0.198 mmol。上述各種不飽和脂肪酸的不飽和度依次增大(分別含有 1、2、3、4、5 個不飽和鍵)，但本試驗(yàn)結(jié)果表明處于中等量的α-亞麻酸組的總VFA濃度較其他組高，提示一定量的不飽和脂肪酸通過對微生物的調(diào)控促進(jìn)了培養(yǎng)液的發(fā)酵;而不飽和程度更多的花生四烯酸和二十碳五烯酸可能是對微生物的負(fù)面作用大于通過抑制原蟲提高細(xì)菌的正面作用，從而提示該添加水平致使微生物細(xì)胞的損害程度較大，而其適宜的添加水平有待進(jìn)一步的研究。

3.2 不同種類長鏈脂肪酸對乙酸/丙酸的影響

乙酸和丙酸均能在反芻動物代謝過程中提供能量，且丙酸發(fā)酵產(chǎn)生的能量較多，乙酸/丙酸過高會影響能量的利用效率［14］;過低則會影響奶牛牛奶的乳脂率［15］。由本試驗(yàn)結(jié)果可看出，0～3 h內(nèi)，乙酸/丁酸均呈下降趨勢，而丙酸在總VFA中的摩爾濃度百分比則呈上升趨勢。這可能是由于原蟲發(fā)酵的主要終產(chǎn)物是乙酸和丁酸，產(chǎn)生丙酸的濃度很低［16］，而不飽和脂肪酸抑制瘤胃原蟲，使原蟲數(shù)量減少，導(dǎo)致了乙酸、丁酸產(chǎn)生量和乙酸/丙酸的下降。本試驗(yàn)中3～6 h和9～12 h間的乙酸/丙酸的回升和波動，則可能和不飽和脂肪酸對原蟲抑制作用的持續(xù)時間和效果有關(guān)，也可能和瘤胃微生物的生長周期有關(guān)。Chalupa等［17］也曾報道，飼糧中添加10%不飽和脂肪酸能降低乙酸/丙酸。另外也有試驗(yàn)表明，飼糧中添加脂肪會降低乙酸濃度，增加丙酸濃度，使乙酸/丙酸降低［18-19］;張春梅等［20］利用瘤胃模擬體外產(chǎn)氣法研究添加亞麻酸對瘤胃發(fā)酵的影響試驗(yàn)中，亞麻油組的乙酸/丙酸顯著低于對照組。以上研究與本試驗(yàn)結(jié)果皆有一定的一致性。但本試驗(yàn)中，各組乙酸/丙酸的變化趨勢總體上不存在顯著差異，綜合總VFA濃度的結(jié)果表明，本試驗(yàn)3%的脂肪酸添加水平促進(jìn)了微生物發(fā)酵，但沒有顯著改變乙酸/丙酸模式。

3.3 不同種類長鏈脂肪酸對丁酸在總VFA中的摩爾濃度百分比的影響

丁酸由反芻動物瘤胃中微生物發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生，瘤胃內(nèi)生成的丁酸大部分經(jīng)瘤胃和網(wǎng)胃壁吸收。丁酸在經(jīng)瘤、網(wǎng)胃壁吸收的過程中，大部分轉(zhuǎn)變?yōu)橥w，生成的酮體80%以上是β-羥丁酸，其余是乙酰乙酸和丙酮。β-羥丁酸可在骨骼肌和心肌中氧化，也可用于脂肪組織和乳腺的脂肪酸合成。丁酸還是上皮細(xì)胞的能量來源，可以促進(jìn)胃腸道細(xì)胞的增殖和成熟［21］，并對啟動瘤胃發(fā)育起首要作用［22］。丁酸同時還抑制乙酸和丙酸在瘤胃上皮中的激活，使瘤胃上皮優(yōu)先利用丁酸，減少了對乙酸的代謝量。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，丁酸在總VFA中的摩爾濃度百分比波動變化，其中α-亞麻酸組明顯低于其他組，且 3、6、9、18 h時與其他組差異顯著。這說明3%的α-亞麻酸對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生丁酸有一定的抑制作用。這和上述的原蟲的代謝終產(chǎn)物是乙酸和丁酸，而該組可能對原蟲的抑制作用較強(qiáng)有關(guān)。綜合總VFA濃度在該組最高而丁酸比例較低的結(jié)果表明，3%的α-亞麻酸可能通過抑制原蟲繁殖，促進(jìn)細(xì)菌繁殖，進(jìn)而促進(jìn)瘤胃微生物的發(fā)酵。我們將進(jìn)一步研究培養(yǎng)液中瘤胃原蟲、瘤胃細(xì)菌的生物量和其群體結(jié)構(gòu)等，以闡明脂肪酸影響微生物發(fā)酵的機(jī)理。另外，由于本試驗(yàn)采用精粗比為60∶40的培養(yǎng)底物，這與目前反芻動物生產(chǎn)中多使用的偏粗型飼糧有一定的差異，因此還需進(jìn)行動物試驗(yàn)來驗(yàn)證生產(chǎn)中是否能達(dá)到預(yù)期的效果。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，培養(yǎng)液中添加3%不同種類的長鏈脂肪酸對總VFA濃度存在一定的調(diào)控作用。隨培養(yǎng)時間的延長，各組乙酸/丙酸總體上呈現(xiàn)下降、上升、再下降和再上升的波動變化趨勢;以α-亞麻酸促進(jìn)瘤胃微生物發(fā)酵，提高總VFA濃度效果較好。

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