章 森 董國忠 周 俊 王 璽 邱 敏 雷春龍 靳 露

(西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶市牧草與草食家畜重點實驗室，重慶 400716)

瘤胃酸中毒是奶牛飼養(yǎng)過程中最常見的營養(yǎng)代謝病。在現(xiàn)代奶牛生產(chǎn)中，為了提高奶牛產(chǎn)奶量，養(yǎng)殖者往往在奶牛飼糧中使用大量精料，這會導(dǎo)致瘤胃酸中毒的發(fā)生率大大提高。瘤胃酸中毒分為急性瘤胃酸中毒(ARA)和亞急性瘤胃酸中毒(SARA)。在實際生產(chǎn)中，SARA更為常見。在SARA條件下，瘤胃內(nèi)會產(chǎn)生大量內(nèi)毒素(即脂多糖)。瘤胃中的內(nèi)毒素通過消化道轉(zhuǎn)運到血漿中，可引起一系列與之相關(guān)的負面反應(yīng)，如引起奶牛免疫活化狀態(tài)升高、影響奶牛的營養(yǎng)代謝、容易暴發(fā)某些特定疾病或并發(fā)其他營養(yǎng)代謝性疾病，從而影響奶牛的生產(chǎn)性能和健康狀況。研究表明，在SARA條件下，血漿內(nèi)毒素可以使血漿非脂化脂肪酸(NEFA)、葡萄糖和乳酸含量升高，使血漿膽固醇、β-羥丁酸含量降低［1-3］。血漿內(nèi)毒素還可以對血漿中鈣、鐵、鋅、磷含量產(chǎn)生影響［4-5］，也可使血漿中游離氨基酸含量產(chǎn)生變化［6-7］。但是，關(guān)于SARA條件下，內(nèi)毒素對奶牛代謝的影響尚缺乏全面的系統(tǒng)研究。本研究針對現(xiàn)階段我國奶牛規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)中優(yōu)質(zhì)粗飼料缺乏、精粗比普遍較高的實際情況，模擬國內(nèi)常見飼糧模式配制奶牛泌乳高峰期飼糧，研究飼糧粗飼料組成和營養(yǎng)水平對奶牛血漿內(nèi)毒素和代謝產(chǎn)物含量的影響，同時進一步研究血漿內(nèi)毒素與代謝產(chǎn)物含量變化的關(guān)系，為SARA及相關(guān)疾病的機理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與設(shè)計

試驗采用單因素隨機區(qū)組設(shè)計，選用經(jīng)產(chǎn)(第2胎)、體況良好及泌乳天數(shù)［(193±21)d］、產(chǎn)奶量和體重相近的荷斯坦奶牛30頭，分為3組，分別為單一秸稈高精料(HCS)組、單一秸稈低精料(LCS)組、混合粗飼料低精料(LMF)組，每組10頭。試驗期56 d。

1.2 試驗飼糧與飼養(yǎng)管理

試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。3組飼糧精飼料種類相同。HCS和LMF組飼糧參照NRC(2001)進行設(shè)計，這2組飼糧營養(yǎng)水平相同(纖維素水平除外)，但精粗比和粗飼料組成不同。LCS與HCS組粗飼料組成相同，但精粗比和營養(yǎng)水平不同。LCS與LMF組精粗比相同，但LCS組的粗飼料品質(zhì)和營養(yǎng)水平低于LMF組。

試驗期每天定時(08:30和17:30)飼喂全混合日糧(TMR)，保證每頭牛都有足夠的TMR，且剩料量不超過投料量的5%。奶牛自由飲水，自由運動，每天定時(08:00和19:00)趕至擠奶廳擠奶2次。擠奶設(shè)備為利拉伐擠奶系統(tǒng)，對設(shè)備每天清洗消毒，擠奶程序嚴格按照標(biāo)準(zhǔn)程序進行。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

1.3 血液采集及前處理

在試驗期第8周的第5天早上飼喂前從尾動脈采取血樣10 mL。采集的血樣裝入肝素鈉抗凝管中，經(jīng)3 000 r/min離心10 min，小心吸取血漿分裝入1.5 mL的多支試管，然后保存于-20℃的冰箱中待測。

1.4 測定指標(biāo)及測定方法

1.4.1 血漿內(nèi)毒素含量的測定

采用顯色基質(zhì)鱟試劑法測定，測定用試劑盒購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司。

1.4.2 血漿代謝產(chǎn)物含量的測定

用雙縮脲比色法測定血漿總蛋白含量，溴甲酚綠比色法測定血漿白蛋白含量，GOD/HK法測定血漿葡萄糖含量，膽固醇氧化酶法測定血漿總膽固醇含量，最后用總蛋白含量減去白蛋白含量得出血漿球蛋白含量，檢測所用儀器為GF-2280全自動生化分析儀(山東高密彩虹分析儀器有限公司)。血漿D-乳酸和NEFA含量利用試劑盒來測定，測定用試劑盒購自南京建成生物工程研究所。血漿β-羥丁酸含量采用比色法在日立7160全自動生化儀上測定，測定用試劑盒購自寧波瑞源生物科技有限公司。

血漿游離氨基酸包括賴氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、絲 氨 酸 (Ser)、甘 氨 酸 (Gly)、色 氨 酸(Trp)、谷氨酸(Glu)、纈 氨 酸 (Val)、蘇氨酸(Thr)、鳥 氨 酸(Orn)、胱 氨 酸 (Cys)、組 氨 酸(His)、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)、脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)含量及血漿總游離氨基酸含量采用日立L-8800型氨基酸自動分析儀進行測定。操作過程如下:準(zhǔn)確取血漿樣品0.8 mL于5 mL塑料離心管中，加入0.8 mL 4%磺基水楊酸溶液，振蕩搖勻。將離心管于12 000 r/min離心5 min，用0.22μm濾膜過濾上機分析。1個樣品分析周期為53 min，分析儀有2個流路和2根柱子。分離柱(4.6 mm×60 mm):洗脫液流經(jīng)此柱，流速0.40 mL/min，柱溫70℃，柱壓13.798 MPa;反應(yīng)柱:茚三酮及茚三酮緩沖液流經(jīng)此柱，流速0.35 mL/min，柱溫135℃，柱壓為0.780 MPa。

1.4.3 血漿礦物元素含量的測定

用二甲苯胺藍比色法測定血漿鎂含量，偶氮砷Ⅲ比色法測定血漿鈣含量，紫外分光光度法測定血漿磷含量，所用儀器為GF-2280全自動生化分析儀(山東高密彩虹分析儀器有限公司)。血漿鈉、鉀、銅、錳、鋅、鐵、硒含量采用TAS-990FG石墨爐原子吸收分光光度計(北京普析儀器有限公司)測定，測定時采用自吸扣背景方式。按照儀器系統(tǒng)推薦程序進行加熱。血漿樣品用含1 mg/L硝酸鈀的硝酸溶液(1%的硝酸溶液)進行稀釋。用標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后算出各個樣品的元素含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)先用Excel 2003進行初步整理分析，再用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件線性模型進行統(tǒng)計分析，考慮的影響因素為試驗處理。采用LSD法進行多重比較，以 P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.10表示有差異趨勢。所有結(jié)果數(shù)據(jù)以最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。最后選取差異顯著的指標(biāo)，用GraphPad Prim 5軟件將其與血漿內(nèi)毒素含量進行線性回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 飼糧粗飼料組成和營養(yǎng)水平對奶牛血漿內(nèi)毒素含量的影響

由表2可知，HCS組血漿內(nèi)毒素含量顯著高于LCS組(P＜0.05)，同時也有高于LMF組的趨勢(P＞0.05)。

2.2 飼糧粗飼料組成和營養(yǎng)水平對奶牛血漿代謝產(chǎn)物含量的影響

由表3可知，3組奶牛血漿總蛋白、白蛋白、球蛋白、總膽固醇、葡萄糖、D-乳酸含量均無顯著差異(P＞0.05)。HCS組血漿NEFA含量分別極顯著高于 LCS和 LMF組(P＜0.01)，而 LCS和LMF組血漿NEFA含量基本一致(P＞0.05)。LCS和LMF組血漿β-羥丁酸含量極顯著高于HCS組(P＜0.01)，而LCS和LMF組血漿β-羥丁酸含量無顯著差異(P＞0.05)。由圖2可知，血漿內(nèi)毒素和NEFA含量呈極顯著的正相關(guān)(P＜0.01)。由圖3可知，血漿內(nèi)毒素和β-羥丁酸含量呈負相關(guān)趨勢(P＜0.10)。

由表4可知，LCS組血漿總游離氨基酸含量顯著低于HCS和LMF組(P＜0.05)。LMF組血漿Lys、Cys和 Asp含量顯著高于 HCS組(P＜0.05)。

表2 飼糧粗飼料組成和營養(yǎng)水平對奶牛血漿內(nèi)毒素含量的影響Table 2 Effects of dietary roughage composition and nutrient levels on plasma endotoxin content in dairy cows

表3 飼糧粗飼料組成和營養(yǎng)水平對奶牛血漿代謝產(chǎn)物含量的影響Table 3 Effects of dietary roughage composition and nutrient levels on plasma metabolite contents in dairy cows

圖1 血漿內(nèi)毒素和NEFA含量的關(guān)系Fig.1 Relationship between plasma contents of endotoxin and EFA

2.3 飼糧粗飼料組成和營養(yǎng)水平對奶牛血漿礦物元素含量的影響

由表5可知，HCS組血漿銅含量極顯著高于LCS和LMF組(P＜0.01)，而 LCS和 LMF組血漿銅含量無顯著差異(P＞0.05)。LCS和LMF組血漿鐵含量極顯著高于HCS組(P＜0.01)，而LMF組血漿鐵含量顯著高于LCS組(P＜0.05)。LMF組血漿錳含量極顯著高于HCS組(P＜0.01)，也顯著高于LCS組高(P＜0.05)，而LCS組血漿錳含量顯著高于HCS組(P＜0.05)。HCS組血漿鈣含量顯著高于LCS和LMF組(P＜0.05)，而LCS和LMF組血漿鈣含量無顯著差異(P＞0.05)。HCS組血漿磷含量顯著高于LCS和LMF組(P＜0.05)，而LCS和LMF組血漿磷含量無顯著差異(P＞0.05)。如圖3所示，血漿內(nèi)毒素與銅含量呈顯著的正相關(guān)(P＜0.05)。如圖4所示，血漿內(nèi)毒素與錳含量呈極顯著的負相關(guān)(P＜0.01)。

圖2 血漿內(nèi)毒素和β-羥丁酸含量的關(guān)系Fig.2 Relationship between plasma endotoxin and β-hydroxybutyric acid contents

表4 飼糧粗飼料組成和營養(yǎng)水平對奶牛血漿游離氨基酸含量的影響Table 4 Effects of dietary roughage composition and nutrient levels on plasma free amino acid contents in dairy cows μmol/L

表5 飼糧粗飼料組成和營養(yǎng)水平對奶牛血漿礦物元素含量的影響Table 5 Effects of dietary roughage composition and nutrient levels on plasma mineral element contents in dairy cows

3 討論

3.1 飼糧粗飼料組成和營養(yǎng)水平對奶牛血漿內(nèi)毒素含量的影響

本研究結(jié)果表明，HCS組血漿內(nèi)毒素含量顯著 高 于 LCS 組，與 Andersen 等［8］、Dougherty等［9］、Khafipour 等［1］、張瑞陽等［10］、吳永霞［11］的研究結(jié)果一致。在精粗比相同而粗飼料組成和營養(yǎng)水平不同的LCS和LMF組之間，血漿內(nèi)毒素含量的差異不顯著。因此，血漿內(nèi)毒素含量主要受到飼糧精粗比的影響，而飼糧粗飼料組成及營養(yǎng)水平的不同對血漿內(nèi)毒素含量的影響不大。

3.2 飼糧粗飼料組成和營養(yǎng)水平對奶牛血漿代謝產(chǎn)物含量的影響

Zebeli等［2］用高精料飼糧飼喂奶牛，發(fā)現(xiàn)血漿NEFA和葡萄糖含量增高與瘤胃內(nèi)毒素含量升高有很強的一致性，而血漿總膽固醇、β-羥丁酸含量卻隨著瘤胃內(nèi)毒素含量的降低而降低。Ametaji等［3］報道，增加奶牛飼糧中大麥比例(0、15%、30%、45%)使血漿中葡萄糖和NEFA含量升高，使血漿中β-羥丁酸、總膽固醇含量下降。另外，Waldron等［12］對泌乳期奶牛靜脈注射內(nèi)毒素，同樣發(fā)現(xiàn)血漿葡萄糖和NEFA含量上升，而血漿中β-羥丁酸含量下降。本研究中，HCS組血漿內(nèi)毒素含量最高，其血漿NEFA含量也是最高，而血漿β-羥丁酸含量最低，與上述研究結(jié)果一致。本研究中，血漿內(nèi)毒素和NEFA含量呈極顯著的正相關(guān)，血漿內(nèi)毒素和β-羥丁酸含量呈負相關(guān)趨勢，這也驗證了上述研究結(jié)果。盡管3組奶牛血漿葡萄糖和總膽固醇含量差異不顯著，但是它們的變化趨勢仍然與上述研究結(jié)果相符。

圖3 血漿內(nèi)毒素和銅含量的關(guān)系Fig.3 Relationship between plasma endotoxin and Cu contents

圖4 血漿內(nèi)毒素和錳含量的關(guān)系Fig.4 Relationship between plasma endotoxin and Mn contents

對于NEFA來說，HCS組飼糧中精料比例高，瘤胃發(fā)酵速度快，所以血漿中NEFA含量會增高［3］。另外，HCS組血漿內(nèi)毒素含量較高，引起機體免疫活化，為了滿足機體免疫系統(tǒng)對能量的需求，奶牛動用體脂，因此血漿 NEFA含量升高［3］。另外，LCS和LMF組的血漿NEFA含量無顯著差異，這說明血漿NEFA含量與飼糧粗飼料組成和營養(yǎng)水平關(guān)系不大。對于β-羥丁酸來說，HCS組β-羥丁酸含量低的原因有2個:第一，飼糧中精料比例較高，所發(fā)酵產(chǎn)生的丁酸含量降低，而丁酸是β-羥丁酸的重要前體物質(zhì)，因此β-羥丁酸含量下降。第二，外周血液中的內(nèi)毒素使血漿葡萄糖和胰島素含量升高，而葡萄糖和胰島素繼而刺激肝細胞，使其生酮作用減弱，因此產(chǎn)生的β-羥丁酸含量減少［3］。在對奶牛灌注外源內(nèi)毒素的試驗中，同樣發(fā)現(xiàn)血漿 β-羥丁酸含量降低［12］。因此，在這2種原因中，可能以第2種為主要原因。另外，LCS和LMF組血漿NEFA和β-羥丁酸含量均無顯著差異，這說明血漿β-羥丁酸含量與飼糧粗飼料組成和營養(yǎng)水平關(guān)系不大。總之，血漿NEFA和β-羥丁酸含量主要受到飼糧精粗比的影響，并與血漿內(nèi)毒素含量關(guān)系密切，而與飼糧粗飼料組成和營養(yǎng)水平關(guān)系不大。

Waggoner等［6-7］在人工注射內(nèi)毒素引起肉牛免疫反應(yīng)的試驗中，發(fā)現(xiàn)牛血漿中的Lys、Met、Ile、Leu、Phe、Ser、Gly、Trp、Asp、Glu、Val、Thr 和 Orn含量下降，而Cys、His、Gln和Asn含量基本不受影響。張石蕊等［13］用不同精粗比飼糧飼喂南方奶牛時發(fā)現(xiàn)，高精料組(精粗比為60∶40)的奶牛血漿中Asp、Glu、Ser、Gly、Tyr、His、Met、Val、Phe、Lys 含量比低精料組(精粗比為40∶60)低，同時高精料組血漿中Ala、Thr、Arg、Leu含量比低精料組高。本研究中，LCS組血漿總游離氨基酸含量同時低于HCS和LMF組，這是因為LCS組營養(yǎng)水平低于HCS和LMF組。LCS組粗蛋白質(zhì)含量為13.9%(干物質(zhì)基礎(chǔ))，而HCS和LMF組分別為16.9%和16.8%。因此，LCS組各游離氨基酸含量普遍偏低。HCS和LMF組營養(yǎng)水平相近，且HCS組血漿內(nèi)毒素含量比LMF組高，2組間血漿Lys和Asp含量的差異與 Waggoner等［6-7］和張石蕊等［13］的研究結(jié)果一致。2組間血漿Cys含量的差異與 Waggoner等［6-7］和張石蕊等［13］的研究結(jié)果不一致。

事實上，在動物體內(nèi)，Cys參與合成谷胱甘肽和一些自由基清除劑［14］，Asp普遍存在于生物合成作用中，Lys是急性期蛋白的重要組成成分，當(dāng)機體發(fā)生免疫反應(yīng)時，它被免疫細胞吸收并合成急性期蛋白［15］。本研究中，HCS組血漿內(nèi)毒素含量高，機體免疫狀態(tài)較高，Cys參與抗氧化作用，Asp廣泛參與各種生物合成作用，Lys也參與急性期蛋白的合成，可能導(dǎo)致了HCS組血漿中的這3種氨基酸含量低于LMF組。另外，盡管差異不顯著，但是 HCS 和 LMF 組血漿 Thr、Ser、Glu、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe 含量的變化趨勢與 Waggoner等［6-7］研究結(jié)果一致。綜上所述，飼糧營養(yǎng)水平是影響血漿游離氨基酸含量的重要因素，在營養(yǎng)水平基本一致的情況下，飼糧精粗比對奶牛血漿游離氨基酸含量有一定的影響。

3.3 飼糧粗飼料組成和營養(yǎng)水平對奶牛血漿礦物元素含量的影響

Zebeli等［4］用大麥含量分別為 0、15%、30%和45%的飼糧來飼喂4組奶牛時，發(fā)現(xiàn)血漿中鈣、鐵和鋅含量隨著精料含量的升高而呈曲線變化。血漿中鈣、鐵和鋅含量最高的是采食大麥含量為15%飼糧的奶牛;血漿中鈣、鐵和鋅含量最低的是采食大麥含量為45%飼糧的奶牛。Waldron等［5］對泌乳期的奶牛靜脈灌注大腸桿菌內(nèi)毒素后，發(fā)現(xiàn)血漿鈣、磷含量與內(nèi)毒素含量呈負相關(guān)性，鎂含量不受內(nèi)毒素含量的影響。本研究中，血漿鐵、鎂和鋅含量變化規(guī)律符合以上研究結(jié)果，而血漿鈣和磷含量不符合以上研究結(jié)果。鞏慶亮［16］用精料含量不同(30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、100%)的飼糧飼喂奶牛時，發(fā)現(xiàn)血漿鈣、磷、鉀、鐵、銅、錳含量均呈現(xiàn)二次曲線變化，在50%或55%精料組出現(xiàn)拐點，其中45%精料組的血漿鉀、銅、錳、鋅含量均高于 70%精料組，而45%精料組的血漿鈣、磷、鐵含量卻低于70%精料組。本研究中的血漿鈣、磷、鉀、鋅、錳含量變化規(guī)律符合此研究結(jié)果，而血漿鐵、銅含量變化與此研究結(jié)果不符合。

對于血漿鐵來說，有研究表明，鐵主要參與C反應(yīng)蛋白(CRP)的合成，與機體的急性期反應(yīng)有關(guān)［17］。本研究中，HCS組精料比例大，血漿內(nèi)毒素含量高，可能導(dǎo)致急性期反應(yīng)強烈，最終可能導(dǎo)致HCS組血漿鐵含量降低。對于血漿銅來說，銅在某些免疫相關(guān)酶的激活過程中起著重要作用，在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性期反應(yīng)中，銅和鋅的相互配合共同穩(wěn)定急性期蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)［18］。本研究中，HCS組血漿內(nèi)毒素含量高，可能急性期反應(yīng)較強，血漿銅大量用于免疫反應(yīng)，可能導(dǎo)致大量組織內(nèi)儲存的銅進入血漿，使血漿銅含量升高。目前，關(guān)于血漿錳和內(nèi)毒素的關(guān)系的報道還很少，有待于進行深入的研究。由圖4和圖5可知，血漿銅和錳含量與內(nèi)毒素含量的關(guān)系密切。另外，LCS和LMF組血漿鐵、錳含量也有顯著的差異，這可能是由于粗飼料組成不同所造成的。

對于血漿鈣、磷來說，本研究的研究結(jié)果與Zebeli等［4］和 Waldron 等［5］的研究結(jié)果不一致。研究表明，血鈣可以通過穩(wěn)定急性期蛋白的構(gòu)型以達到協(xié)助機體消除內(nèi)毒素的目的［4］，特別是可以促進淀粉樣蛋白-A單體聚合成淀粉樣大分子來發(fā)揮消除內(nèi)毒素的作用［18］。血漿磷能緩沖血液pH。血漿鈣、磷含量可能受到很多因素調(diào)控。Petzl等［19］給奶牛注射內(nèi)毒素(每15 min注射1次)，發(fā)現(xiàn)奶牛會產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受現(xiàn)象，受到240 h LPS刺激的奶牛其耐受性要高于受到70 h內(nèi)毒素刺激的奶牛。Petzl等［19］還指出，產(chǎn)生LPS耐受性的奶牛體內(nèi)的白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α等免疫相關(guān)因子的基因表達并不活躍。因此，若是長期用高精料飼糧飼喂奶牛，盡管奶牛血漿內(nèi)毒素含量升高，但是部分奶牛有可能產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受現(xiàn)象。另外，Goff等［20］指出，甲狀旁腺素、前列腺素以及造骨細胞分泌IL-6以刺激破骨細胞，使之加強破骨作用，從而提高血漿中鈣和無機磷含量。動物體鈣和磷的平衡主要受2種激素影響:一種是由甲狀旁腺分泌的甲狀旁腺激素，它可促使骨鹽溶解以提高血鈣含量，血漿甲狀旁腺激素含量主要受到血漿鈣含量的調(diào)控;另一種是在腎臟內(nèi)產(chǎn)生的1，25-二羥維生素D3，它是維生素D3的活性形式。本研究是在飼喂奶牛8周后進行的血樣采集，這個時候部分奶?？赡墚a(chǎn)生內(nèi)毒素耐受現(xiàn)象，加之奶牛自身體液調(diào)節(jié)影響，因此本研究中HCS組的血漿鈣和磷含量并未降低。

4 結(jié)論

①血漿內(nèi)毒素含量隨著飼糧精粗比的升高而升高，而與飼糧營養(yǎng)水平及飼糧粗飼料組成關(guān)系不大。

②血漿NEFA、銅、鈣和磷含量隨著飼糧精粗比的升高而升高，血漿β-羥丁酸、錳含量隨著飼糧精粗比的升高而下降，且它們與血漿內(nèi)毒素含量有著密切關(guān)系。血漿游離氨基酸總體上受到飼糧營養(yǎng)水平和精粗比的綜合影響。

③飼糧精粗比會影響血漿中內(nèi)毒素含量，后者進而引起血漿部分代謝產(chǎn)物含量的變化。這種變化可能會對動物健康狀況和生產(chǎn)性能產(chǎn)生影響，值得進一步深入研究。

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