牛文靜 趙廣永 張婷婷 鄭文思

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)生成的甲烷(CH4)以噯氣的形式釋放到大氣中。一方面，CH4能占攝入飼料總能的2% ～15%，瘤胃中CH4的產(chǎn)生降低了飼料能量的利用效率［1］;另一方面，CH4是溫室氣體。反芻動(dòng)物產(chǎn)生的CH4大約占釋放到大氣中CH4總量的15%，其對(duì)地球溫室效應(yīng)的影響占所有影響因素的15% ～20%［2］。因此，減少反芻動(dòng)物 CH4產(chǎn)量不僅有利于提高反芻動(dòng)物對(duì)飼料能量的利用效率，而且也有利于緩解地球的溫室效應(yīng)。

稻草是我國(guó)重要的粗飼料資源。稻草的粗纖維含量高，粗蛋白質(zhì)含量低，適口性差，消化率低。反芻動(dòng)物對(duì)未加工處理稻草的消化率一般僅為50%左右。秸稈氨化技術(shù)經(jīng)濟(jì)實(shí)用，簡(jiǎn)單易行。研究表明，利用尿素對(duì)稻草進(jìn)行氨化處理，能夠提高稻草的粗蛋白質(zhì)含量，降低粗纖維含量，提高干物質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的瘤胃降解率［3］。李兵等［4］研究結(jié)果顯示，隨著尿素水平的提高，氨化稻草的可消化性提高，但瘤胃發(fā)酵的CH4產(chǎn)量也同時(shí)提高。如何應(yīng)用氨化技術(shù)，在提高反芻動(dòng)物對(duì)稻草的消化率的同時(shí)，使氨化稻草在瘤胃發(fā)酵過(guò)程中的CH4產(chǎn)量不增加或減少，是應(yīng)該用秸稈氨化技術(shù)面臨的重要問(wèn)題。

延胡索酸是生物體三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，延胡索酸還原菌能夠把延胡索酸還原成琥珀酸，進(jìn)一步形成丙酸［5］。延胡索酸二鈉(disodium fumarate，DF)是有效的氫氣(H2)受體，能夠促進(jìn)丙酸生成，降低CH4產(chǎn)量［6］。因而，延胡索酸有利于降低瘤胃 CH4的產(chǎn)量。López等［7］研究表明，延胡索酸二鈉能夠降低CH4產(chǎn)量，提高飼料干物質(zhì)消化率。Carro等［8］研究表明，延胡索酸二鈉能夠提高體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)產(chǎn)量，降低 CH4產(chǎn)量。Wood等［9］研究結(jié)果顯示，進(jìn)行包被處理的延胡索酸能夠降低瘤胃發(fā)酵CH4產(chǎn)量。本試驗(yàn)擬研究延胡索酸二鈉對(duì)氨化稻草體外瘤胃發(fā)酵CH4和VFA產(chǎn)量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)稻草氨化處理

以使用0(未處理)、4%、6%的尿素氨化處理的稻草作為飼料樣品。氨化稻草的制作按照李兵等［4］的方法進(jìn)行:稱(chēng)取1 kg風(fēng)干稻草，切短至2 cm左右;將40 g尿素溶解于400 mL自來(lái)水，配制成10%(質(zhì)量體積比 )的尿素溶液。量取40 mL 10%的尿素溶液，均勻噴灑在100 g稻草上，使尿素溶液與秸稈混合均勻，制備4%尿素處理的氨化稻草。量取60 mL 10%的尿素溶液，均勻噴灑在100 g稻草上，制備6%尿素處理的氨化稻草。將稻草裝入廣口瓶，每個(gè)處理分別使用10個(gè)廣口瓶，每個(gè)瓶為1個(gè)重復(fù)。將廣口瓶密封，保存在避光處28 d。環(huán)境平均溫度為21.4℃(7.8～31.3℃)。氨化過(guò)程完成后，取出稻草，制備成風(fēng)干樣品，粉碎過(guò)1 mm網(wǎng)篩備用。

1.1.2 延胡索酸二鈉

延胡索酸二鈉，相對(duì)分子質(zhì)量160.04，分析純，純度98%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用3×5雙因素設(shè)計(jì)，即3個(gè)［0(未處理)、4%、6%］尿素水平氨化處理稻草和體外發(fā)酵液中5個(gè)(0、2%、4%、8%、12%)延胡索酸二鈉添加水平。每個(gè)處理設(shè)置10個(gè)重復(fù)，每批發(fā)酵樣品設(shè)置3個(gè)空白。

1.3 瘤胃液供體動(dòng)物及其飼糧

選用2頭體況良好，體重相近，安裝永久性瘤胃瘺管，平均體重約為550 kg的西門(mén)塔爾牛作為瘤胃液供體。試驗(yàn)牛的飼糧包括精飼料2.0 kg/d，粗飼料7.0 kg/d。精飼料組成為:玉米58%、豆粕20%、小麥麩18%、碳酸氫鈣2%、食鹽1%、微量元素預(yù)混料1%。粗飼料為干羊草。每天將飼糧分為相等的2份，分別在07:00和17:00喂牛。瘤胃液供體牛拴系飼養(yǎng)，自由飲水。飼喂15 d后，第16天時(shí)開(kāi)始采集瘤胃液。

1.4 試驗(yàn)方法

采用 Menke等［10］的體外產(chǎn)氣法進(jìn)行發(fā)酵。使用內(nèi)徑為32 mm、長(zhǎng)200 mm、體積最大刻度為100 mL的玻璃注射器作為發(fā)酵器。使用能夠準(zhǔn)確控溫的生化培養(yǎng)箱(SHP-150，上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司)作為控溫裝置。

1.4.1 緩沖液的配制方法［10］

緩沖液 A:稱(chēng)取 CaCl2·2H2O 13.2 g、MnCl2·4H2O 10.0 g、CoCl2·6H2O 1.0 g 和FeCl3·6H2O 8.0 g，溶解于100 mL蒸餾水中。緩沖液B:稱(chēng)取NaHCO335 g和 NH4HCO34 g，溶解于1 000 mL蒸餾水中。緩沖液C:稱(chēng)取Na2HPO45.7 g、KH2PO46.2 g 和 MgSO4·7H2O 0.6 g，溶解于1 000 mL蒸餾水中。

還原劑溶液:將4 mL 1 mol/L NaOH和625 mg Na2S·9H2O添加于95 mL蒸餾水中，制備成溶液，混合均勻。還原劑溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。

緩沖液的混合順序?yàn)?400 mL蒸餾水、0.1 mL緩沖液A、200 mL緩沖液 B、200 mL緩沖液C、40 mL還原劑溶液。

1.4.2 瘤胃液采集與發(fā)酵液的配制

在早晨飼喂后2 h，分別從2頭供體牛的瘤胃中采取瘤胃液250 mL，經(jīng)4層紗布過(guò)濾、混勻后放入保溫瓶中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，測(cè)定其pH。將瘤胃液與混合緩沖液以1∶2的體積比例裝入試劑瓶中，混合均勻，置于39℃水浴恒溫箱中保溫，并持續(xù)通入二氧化碳(CO2)。

1.4.3 體外瘤胃發(fā)酵

分別稱(chēng)取0.200 0 g左右的風(fēng)干稻草樣品，放入每個(gè)注射器內(nèi)。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別向注射器中添加相應(yīng)水平的延胡索酸二鈉。每個(gè)注射器內(nèi)吸取30 mL發(fā)酵液，排空注射器內(nèi)的氣體，密封針頭，記錄注射器活塞的位置，放入39℃生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵。

鑒于秸稈飼料樣品進(jìn)行體外發(fā)酵45～52 h，秸稈的體外消化率和產(chǎn)氣量達(dá)到最高［11-12］，本試驗(yàn)進(jìn)行48 h的體外發(fā)酵。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，記錄注射器活塞的位置，以計(jì)算發(fā)酵過(guò)程中的總產(chǎn)氣量，并收集氣體和發(fā)酵液待測(cè)。

1.5 指標(biāo)測(cè)定與分析

1.5.1 總產(chǎn)氣量

樣品總產(chǎn)氣量為試驗(yàn)處理注射器48 h總產(chǎn)氣量與空白處理注射器48 h總產(chǎn)氣量之差。

1.5.2 CH4、CO2和 H2產(chǎn)量

利用氣相色譜儀(TP-2060T，北京北分天普儀器技術(shù)有限公司)測(cè)定氣體樣品中的CH4、CO2和H2產(chǎn)量。

1.5.3 VFA產(chǎn)量

發(fā)酵結(jié)束后，采集5 mL發(fā)酵液，裝入50 mL離心管內(nèi)，在15 000×g下離心15 min。準(zhǔn)確吸取上清液1 mL于2 mL離心管中，并加入250μL 25%(質(zhì)量體積比)的偏磷酸溶液充分混合，在15 000×g下再次離心15 min，吸取2μL上清液，應(yīng)用氣相色譜儀測(cè)定VFA產(chǎn)量。

1.5.4 計(jì)算公式

式中:Y樣品為樣品48 h產(chǎn)氣量(mL/g)或VFA產(chǎn)量(μmol/g);Y試驗(yàn)為試驗(yàn)處理發(fā)酵液48 h產(chǎn)氣量(mL/g)或 VFA 產(chǎn)量(μmol/g);Y空白為空白處理48 h產(chǎn)氣量(mL/g)或VFA產(chǎn)量(μmol/g);DM為樣品干物質(zhì)含量(g)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)分析軟件的one-way ANOVA對(duì)各處理的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，差異顯著者采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。統(tǒng)計(jì)分析模型為:

式中:Yij表示觀測(cè)值;μ表示所有觀測(cè)值的平均值;αi表示尿素氨化稻草第i水平的處理效果(i=1、2、3);βj表示延胡索酸二鈉第 j水平的處理效果(j=1、2、3、4、5、6);εij表示隨機(jī)誤差。

2 結(jié)果

2.1 延胡索酸二鈉對(duì)氨化稻草體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

從表1可以看出，延胡索酸二鈉提高了未處理和氨化稻草體外瘤胃發(fā)酵的總產(chǎn)氣量和CO2產(chǎn)量，其中2%延胡索酸二鈉顯著提高了未處理稻草的總產(chǎn)氣量(P＜0.05)，12%延胡索酸二鈉顯著提高了6%尿素氨化稻草的總產(chǎn)氣量(P＜0.05)。12%延胡索酸二鈉顯著降低了4%尿素氨化稻草的H2產(chǎn)量(P＜0.05)。延胡索酸二鈉降低了CH4/總產(chǎn)氣量和CH4/總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)，其中8%和12%延胡索酸二鈉顯著降低了4%尿素氨化稻草的CH4/總產(chǎn)氣量(P＜0.05)，12%延胡索酸二鈉顯著降低了6%尿素氨化稻草的CH4/總產(chǎn)氣量(P＜0.05)，2%、4%、8%和12%延胡索酸二鈉顯著降低了未處理稻草的CH4/TVFA(P＜0.05)，12%延胡索酸二鈉顯著降低了4%尿素稻草的CH4/TVFA(P＜0.05)。

隨尿素水平的提高，稻草的總產(chǎn)氣量和CO2產(chǎn)量顯著提高(P＜0.05)，CH4/總產(chǎn)氣量和CH4/TVFA顯著下降(P＜0.05)，但其他指標(biāo)沒(méi)有顯著變化(P＞0.05)。

尿素水平對(duì)各指標(biāo)均存在顯著影響(P＜0.05)，延胡索酸二鈉添加水平對(duì)除H2產(chǎn)量外的各指標(biāo)影響均顯著(P＜0.05)，尿素和延胡索酸二鈉對(duì)總產(chǎn)氣量、CH4產(chǎn)量、CH4/總產(chǎn)氣量、CH4/TVFA均存在顯著的交互作用(P＜0.05)。

2.2 延胡索酸二鈉對(duì)氨化稻草體外瘤胃發(fā)酵VFA產(chǎn)量的影響

從表2可以看出，延胡索酸二鈉降低了未處理和氨化稻草的乙酸/丙酸，其中2%、4%、8%和12%的延胡索酸二鈉顯著降低了未處理和6%尿素氨化稻草乙酸/丙酸(P＜0.05)，8%和12%的延胡索酸二鈉顯著降低了4%尿素氨化稻草乙酸/丙酸(P＜0.05)。延胡索酸二鈉提高了丙酸產(chǎn)量，其中，8%和12%的延胡索酸二鈉顯著提高了未處理和4%尿素氨化稻草的丙酸產(chǎn)量?？傮w上，延胡索酸二鈉能夠降低乙酸和丁酸產(chǎn)量，僅8%延胡索酸二鈉顯著降低了6%尿素氨化稻草的乙酸產(chǎn)量(P＜0.05)，2%、4%、8%和12%的延胡索酸二鈉僅顯著降低了6%尿素氨化稻草的丁酸產(chǎn)量(P＜0.05)。TVFA產(chǎn)量未呈現(xiàn)一致性規(guī)律。

隨著尿素水平的提高，TVFA、乙酸、丙酸和丁酸的產(chǎn)量顯著提高(P＜0.05)。

尿素水平對(duì)除丁酸/TVFA外的各指標(biāo)均存在顯著影響(P＜0.05)，延胡索酸二鈉添加水平對(duì)除TVFA產(chǎn)量外的各指標(biāo)均存在顯著影響(P＜0.05)，但是二者僅對(duì)乙酸、丙酸和TVFA產(chǎn)量的影響存在顯著交互作用(P＜0.05)。

3 討論

3.1 延胡索酸二鈉對(duì)氨化稻草體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

López等［7］的體外發(fā)酵試驗(yàn)表明，延胡索酸二鈉添加水平為5～10 mmol/L時(shí)，提高了飼糧的總產(chǎn)氣量，降低了CH4產(chǎn)量，對(duì)H2產(chǎn)量沒(méi)有顯著影響。Carro等［8］報(bào)道，延胡索酸二鈉添加水平為4～10 mmol/L時(shí)，降低了飼糧體外發(fā)酵的CH4產(chǎn)量，但對(duì)總產(chǎn)氣量沒(méi)有影響。本試驗(yàn)向每個(gè)注射器發(fā)酵液中添加的延胡索酸二鈉水平分別為0、0.83、1.67、3.33、5.01 mmol/L。結(jié)果顯示，延胡索酸二鈉能夠顯著提高未處理和氨化稻草體外發(fā)酵的總產(chǎn)氣量和CO2產(chǎn)量，沒(méi)有降低CH4的絕對(duì)產(chǎn)量，但是能夠顯著降低其相對(duì)產(chǎn)量，即CH4/總產(chǎn)氣量和CH4/TVFA。本試驗(yàn)結(jié)果與上述報(bào)道一致。總產(chǎn)氣量是衡量飼料可消化性的重要指標(biāo)。延胡索酸二鈉提高了未處理和氨化稻草總產(chǎn)氣量，說(shuō)明延胡索酸二鈉有促進(jìn)纖維素消化的作用［6］。延胡索酸二鈉降低了未處理以及4%和6%尿素氨化稻草CH4相對(duì)產(chǎn)量的原因，可能是延胡索酸二鈉促進(jìn)了延胡索酸還原菌的生長(zhǎng)，從而與產(chǎn) CH4菌競(jìng)爭(zhēng) H2，減少了 CH4的相對(duì)產(chǎn)量［5］。這說(shuō)明，延胡索酸二鈉不僅能夠降低飼糧的CH4產(chǎn)量，而且也能夠降低未處理和氨化稻草瘤胃發(fā)酵CH4的相對(duì)產(chǎn)量。

表1 延胡索酸二鈉對(duì)氨化稻草體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Effects of DF on gas production of ammoniated rice straw after in vitro rumen fermentation(DM basis)

3.2 延胡索酸二鈉對(duì)氨化稻草體外瘤胃發(fā)酵VFA產(chǎn)量的影響

López等［7］應(yīng)用自由采食苜蓿干草并補(bǔ)飼300 g精飼料的綿羊瘤胃液對(duì)飼糧進(jìn)行體外發(fā)酵，結(jié)果顯示，延胡索酸二鈉提高了乙酸和丙酸的產(chǎn)量。Carro等［8］的研究也顯示，延胡索酸二鈉提高了飼糧體外發(fā)酵乙酸、丙酸和TVFA的產(chǎn)量，降低了乙酸/丙酸。本試驗(yàn)結(jié)果表明，延胡索酸二鈉能夠顯著降低未處理和氨化稻草的乙酸/丙酸，顯著提高丙酸產(chǎn)量，顯著降低乙酸和丁酸產(chǎn)量。與前者結(jié)果一致。這說(shuō)明，延胡索酸二鈉是有效的H2受體，能夠促進(jìn)丙酸生成，降低CH4產(chǎn)量［6］。

一般情況下，粗飼料在瘤胃中發(fā)酵的乙酸產(chǎn)量顯著高于丙酸產(chǎn)量。但粗飼料在瘤胃中發(fā)酵的乙酸和丙酸實(shí)際產(chǎn)量與粗飼料的結(jié)構(gòu)性碳水化合物(纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、果膠)和非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(淀粉、可溶性糖)的含量及其可發(fā)酵程度密切相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，稻草發(fā)酵的乙酸產(chǎn)量?jī)H略高于丙酸產(chǎn)量。這可能是由于稻草是低質(zhì)粗飼料，其結(jié)構(gòu)性碳水化合物可發(fā)酵程度較低。

在生產(chǎn)實(shí)踐中，使用未處理和氨化稻草飼喂反芻動(dòng)物時(shí)，可通過(guò)向飼糧中添加適量的延胡索酸二鈉抑制瘤胃中CH4的產(chǎn)生，但仍需要應(yīng)用動(dòng)物試驗(yàn)研究確定在不同飼糧條件下延胡索酸二鈉的適宜添加水平。

4 結(jié)論

延胡索酸二鈉提高了未處理和氨化稻草體外發(fā)酵的總產(chǎn)氣量，降低了乙酸/丙酸和CH4的相對(duì)產(chǎn)量，可用于未處理和氨化稻草瘤胃CH4減排。

［1］HOLTER J B，YONG A J.Methane prediction in dry and lactating Holstein cows［J］.Journal of Dairy Science，1992，75(8):2165-2175.

［2］MOSS A R，JOUANY J，NEWBOLD J.Methane production by ruminants:its contribution to global warming［J］.Annales de Zootechnie，2000，49(3):231-253.

［3］劉春龍，孫鳳俊，李長(zhǎng)勝，等.不同的處理方法對(duì)稻草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響［J］.黃牛雜志，2002，28(1):28-29.

［4］李兵，王滿紅，劉繼軍，等.不同尿素水平氨化稻草體外培養(yǎng)發(fā)酵的產(chǎn)氣規(guī)律［J］.中國(guó)畜牧雜志，2011，47(21):34-37.

［5］周亞文，張玉杰，林波，等.瘤胃甲烷生成過(guò)程中微生物之間的相互關(guān)系［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011，23(4):556-562.

［6］NEWBOLD C J，LóPEZ S，NELSON N，et al.Propionate precursors and other metabolic intermediates as possible alternative electron acceptors to methanogenesis in ruminal fermentation in vitro［J］.British Journal of Nutrition，2005，94(1):27-35.

［7］LóPEZ S，VALDéS C，NEWBOLD C J，et al.Influence of sodium fumarate addition on rumen fermentation in vitro［J］.British Journal of Nutrition，1999，81(1):59-64.

［8］CARRO M D，RANILLA M J.Influence of different concentrations of disodium fumarate on methane production and fermentation of concentrate feeds by rumen microorganisms in vitro［J］.British Journal of Nutrition，2003，90(3):617-623.

［9］WOOD T A，WALLACE R J，ROWE A，et al.Encapsulated fumaric acid as a feed ingredient to decrease ruminal methane emissions［J］.Animal Feed Science and Technology，2009，152(1/2):62-71.

［10］MENKE K H，RAAB L，SALEWSKI A，et al.The estimation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feeding stuffs from the gas production when they are incubated with rumen liquor in vitro［J］.Journal of Agricultural Science，1979，93(1):217-222.

［11］PRASAD C S，WOOD C D，SAMPATH K T.Use of in-vitro gas production to evaluate rumen fermentation of untreated and urea treated finger millet straw(Eleusine coracana)supplemented with different levels of concentrates［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，1994，65(4):457-464.

［12］LIU J X，SUSENBETH A，SüDEKUM K H.In vitro gas production measurements to evaluate interactions between untreated and chemically treated rice straws，grass hay，and mulberry leaves［J］.Journal of Animal Science，2002，80(2):517-524.