尚沁沁 黃 琴 徐 歆 史艷云 李衛(wèi)芬 余東游

(浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院飼料科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部華東動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058)

益生菌是指對(duì)人畜有益的活體微生物［1］。外源性益生菌進(jìn)入腸道后，通過(guò)促進(jìn)機(jī)體腸道微生態(tài)平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、維持養(yǎng)殖生態(tài)平衡，最終達(dá)到促生長(zhǎng)和提高抗病力等益生作用，并具有無(wú)毒性、無(wú)殘留、無(wú)耐藥性以及無(wú)環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)［2］。益生菌主要通過(guò)免疫調(diào)節(jié)(增強(qiáng)腸道免疫、活化全身免疫系統(tǒng)及減輕炎癥反應(yīng))［3］和非免疫調(diào)節(jié)(改善腸道微生態(tài)平衡和腸道形態(tài)結(jié)構(gòu))［4］2種途徑改善動(dòng)物腸道健康，從而促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis var.natto)B4是枯草芽孢桿菌的一個(gè)亞種［5］，可分解大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，同時(shí)具有抗癌、抗菌、抗氧化、降低膽固醇等功能［6-7］。研究表明，在飼糧中添加納豆芽孢桿菌B4可提高肉雞的平均日采食量和平均日增重［8］，促進(jìn)仔豬腸道乳酸菌定植［9］，提高魚(yú)的非特異性免疫［10］等。目前，關(guān)于益生菌對(duì)機(jī)體免疫影響的研究多集中于乳酸菌，而針對(duì)納豆芽孢桿菌的研究較少。因此，有必要系統(tǒng)、深入地研究飼用納豆芽孢桿菌的作用機(jī)理，特別是其提高動(dòng)物免疫功能的機(jī)理。本試驗(yàn)擬研究納豆芽孢桿菌B4對(duì)Caco-2細(xì)胞活性、黏附與細(xì)胞因子分泌的影響，旨在探索該菌株對(duì)腸黏膜免疫功能的調(diào)控機(jī)理，從而為納豆芽孢桿菌在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

納豆芽孢桿菌B4菌株由浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所農(nóng)業(yè)部華東動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;大腸桿菌(Escherichia coli)K88和霍亂沙門(mén)氏菌(Salmonella choleraesuis)均購(gòu)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心;Caco-2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 主要試劑和設(shè)備

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基(英國(guó) Oxoid公司);麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和SS瓊脂培養(yǎng)基(杭州天和微生物試劑有限公司);DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰酶［含 0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)］、D-Hank’s平衡鹽溶液、胎牛血清(FBS)(美國(guó)Gibco公司);青、鏈霉素(碧云天生物技術(shù)研究所);TritonX-100和臺(tái)盼藍(lán)染色液(美國(guó)Ameresco公司);增殖誘導(dǎo)配體(APRIL)、白細(xì)胞介素 -6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)試盒(美國(guó)R＆D systems公司);乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所);其他試劑均為分析純。

5804R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);HERAcell 150 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Electron公司);CX41-12C02奧林巴斯倒置顯微鏡(日本Olympus公司);SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司);UV-2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司);XSZ-N107CCD光學(xué)顯微鏡(寧波永新光學(xué)股份有限公司);DK-8D恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);SPX-250BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);THZ-C恒溫振蕩器(江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)細(xì)胞及菌株的培養(yǎng)

按照文獻(xiàn)［11］的方法培養(yǎng)細(xì)胞及試驗(yàn)菌株。Caco-2細(xì)胞接種在75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，以含10%FBS和雙抗(100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)的DMEM 培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)為單層細(xì)胞后(5～7 d)，加入0.5 mL 0.25%的胰酶消化傳代。

-80℃保存的納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌分別經(jīng)LB培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和SS瓊脂培養(yǎng)基活化后，接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃，200 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，4 000 r/min離心10 min，收集菌體，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)洗滌2次，最后重懸于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細(xì)菌的濃度為2×108CFU/mL。

1.3.2 細(xì)胞活性檢測(cè)［12］

Caco-2細(xì)胞以1×106個(gè)/mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h使細(xì)胞重新貼壁，試驗(yàn)組分別加入納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌液(1×108CFU/mL)，對(duì)照組加等量含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)共培養(yǎng)，分別進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)和LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)。

臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn):分別在共培養(yǎng)1、3、6 h后，以0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以體積比9∶1混合均勻，取少量以細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞(未著色細(xì)胞)數(shù)、細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率。

LDH細(xì)胞毒性檢測(cè):共培養(yǎng)12 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，以LDH測(cè)試盒檢測(cè)胞外LDH活性，以此確定細(xì)胞的損傷程度。

1.3.3 細(xì)菌黏附試驗(yàn)

按照文獻(xiàn)［13］和［14］的方法熒光標(biāo)記細(xì)菌:試驗(yàn)菌(1×109CFU/mL)懸浮于1 mg/mL異硫氰酸熒光素(FITC)中，37℃暗處作用2 h，PBS洗滌數(shù)次去除未結(jié)合的FITC，重新懸浮于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，并調(diào)整菌液濃度至2×108CFU/mL。Caco-2細(xì)胞以1×106個(gè)/mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h使細(xì)胞重新貼壁，分別進(jìn)行單菌黏附和黏附抑制試驗(yàn)［11］。

單菌黏附試驗(yàn):FITC標(biāo)記的大腸桿菌K88或霍亂沙門(mén)氏菌(1×108CFU/mL)處理Caco-2細(xì)胞1 h，無(wú)菌PBS洗滌3次，胰酶消化收集細(xì)胞，酶標(biāo)儀測(cè)定其相對(duì)熒光強(qiáng)度(RFU)，激發(fā)光波長(zhǎng)為494 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為520 nm，計(jì)算黏附率。

式中:A為每毫升細(xì)胞懸液的RFU;A0為每毫升FITC標(biāo)記菌液的RFU。

黏附抑制試驗(yàn):1)競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)，同時(shí)加入未熒光標(biāo)記的納豆芽孢桿菌B4與FITC標(biāo)記的大腸菌K88或者霍亂沙門(mén)氏菌(均為1×108CFU/mL)處理Caco-2細(xì)胞1 h后，無(wú)菌PBS洗滌3次，胰酶消化收集細(xì)胞，酶標(biāo)儀測(cè)定其RFU，計(jì)算黏附率。2)排斥試驗(yàn)，未標(biāo)記熒光的納豆芽孢桿菌B4(1×108CFU/mL)先處理 Caco-2細(xì)胞 1 h后，無(wú)菌PBS洗滌3次，再加入FITC標(biāo)記的大腸菌K88或者霍亂沙門(mén)氏菌(1×108CFU/mL)處理1 h，無(wú)菌PBS洗滌3次，胰酶消化收集細(xì)胞，酶標(biāo)儀測(cè)定其RFU，計(jì)算黏附率。3)置換試驗(yàn)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的大腸菌K88或者霍亂沙門(mén)氏菌(1×108CFU/mL)處理Caco-2細(xì)胞1 h，無(wú)菌PBS洗滌3次，再加入未熒光標(biāo)記的納豆芽孢桿菌B4處理1 h，胰酶消化收集細(xì)胞，酶標(biāo)儀測(cè)定其RFU，計(jì)算黏附率。

1.3.4 細(xì)胞因子分泌檢測(cè)

Caco-2細(xì)胞以1×106個(gè)/mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h使細(xì)胞重新貼壁，試驗(yàn)組分別以納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌液(1×108CFU/mL)處理12 h，對(duì)照組加等量含10%FBS的 DMEM 培養(yǎng)基，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，以ELISA測(cè)試盒檢測(cè)其中促炎細(xì)胞因子(APRIL、IL-6、IL-8)和抗炎細(xì)胞因子(IL-10)的含量，按說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 納豆芽孢桿菌B4對(duì)Caco-2細(xì)胞活性的影響

由表1可知，大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)后，隨共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸降低，分別從1 h的88.17%和88.67%降低到6 h的72.83%和72.50%，大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌組Caco-2細(xì)胞的存活率極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01);納豆芽孢桿菌B4與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)1、3、6 h后，對(duì)Caco-2細(xì)胞的存活率無(wú)顯著影響(P＞0.05)，且Caco-2細(xì)胞的存活率極顯著高于上述2株病原菌(P＜0.01)。

表1 納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響Table 1 Effects of Bacillus subtilis var.natto B4，Escherichia coli K88 and Salmonella choleraesuis on survival rate of Caco-2 cells %

由表2可知，大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)12 h后胞外LDH活性分別是對(duì)照組的8.1倍和7.9倍，差異均極顯著(P＜0.01)。納豆芽孢桿菌B4與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)12 h后胞外LDH活性極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，但極顯著低于大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌組(P＜0.01)。

2.2 納豆芽孢桿菌B4對(duì)大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌黏附Caco-2細(xì)胞的影響

由表3和表4可知，在競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)、排斥試驗(yàn)和置換試驗(yàn)中，納豆芽孢桿菌B4對(duì)大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌黏附Caco-2細(xì)胞的黏附率無(wú)顯著影響(P＞0.05)，表明該芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌黏附Caco-2細(xì)胞沒(méi)有明顯的阻斷作用。

表2 納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌對(duì)Caco-2細(xì)胞胞外LDH活性的影響Table 2 Effects of Bacillus subtilis var.natto B4，Escherichia coli K88 and Salmonella choleraesuis on extracellular LDH activity of Caco-2 cells U/L

表3 納豆芽孢桿菌B4對(duì)大腸桿菌K88黏附Caco-2細(xì)胞的影響Table 3 Effects of Bacillus subtilis var.natto B4 on adhesion of Escherichia coli K88 to Caco-2 cells %

表4 納豆芽孢桿菌B4對(duì)霍亂沙門(mén)氏菌黏附Caco-2細(xì)胞的影響Table 4 Effects of Bacillus subtilis var.natto B4 on adhesion of Salmonella choleraesuis to Caco-2 cells%

2.3 納豆芽孢桿菌B4對(duì)Caco-2細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響

由表5可知，納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌組Caco-2細(xì)胞分泌APRIL含量極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，而促炎細(xì)胞因子IL-6和IL-8含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，抗炎細(xì)胞因子IL-10含量極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。

3 討論

3.1 納豆芽孢桿菌B4對(duì)Caco-2細(xì)胞活性的影響

益生菌的安全性是其篩選過(guò)程中的基本要求，菌株在最終應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)之前，都必須經(jīng)嚴(yán)格的毒性試驗(yàn)，證明其安全無(wú)毒，方可進(jìn)一步推廣使用。本研究通過(guò)聯(lián)合運(yùn)用臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)和LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)2種方法，分析納豆芽孢桿菌B4對(duì)Caco-2細(xì)胞活性的影響，以此評(píng)估該菌株的安全性。LDH僅存在于細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞膜完整性受損，導(dǎo)致其通透性增加，使LDH由胞內(nèi)泄漏至胞外。因此，胞外LDH活性成為衡量細(xì)胞破損的指標(biāo)之一［15］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌對(duì)Caco-2細(xì)胞造成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，引起胞外LDH活性的極顯著升高，而納豆芽孢桿菌B4對(duì)Caco-2細(xì)胞存在一定的細(xì)胞毒性，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌。臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)結(jié)果顯示，大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌極顯著降低Caco-2細(xì)胞的存活率，而納豆芽孢桿菌B4對(duì)Caco-2細(xì)胞的存活率沒(méi)有顯著的影響。上述2個(gè)試驗(yàn)結(jié)果均表明，納豆芽孢桿菌B4對(duì)Caco-2細(xì)胞無(wú)顯著毒性作用，而大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌對(duì)Caco-2細(xì)胞具有毒性作用。由此可知該芽孢桿菌具有安全性，可選為益生菌。近年來(lái)，通過(guò)對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行安全評(píng)估得出有4株芽孢桿菌未發(fā)現(xiàn)具有致病特點(diǎn)［16-17］，本研究結(jié)果與這些研究相似。

表5 納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌對(duì)Caco-2細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響Table 5 Effects of Bacillus subtilis var.natto B4，Escherichia coli K88 and Salmonella choleraesuis on cytokine secretion of Caco-2 cells

3.2 納豆芽孢桿菌B4對(duì)致病菌黏附的影響

芽孢桿菌制劑具有防病抗病、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能及對(duì)動(dòng)物無(wú)毒無(wú)害、無(wú)殘留等特點(diǎn)，是一種優(yōu)質(zhì)、高效、低殘留、無(wú)污染、綠色環(huán)保的新型飼料添加劑。對(duì)于益生菌的作用機(jī)理，目前普遍認(rèn)為黏附是其發(fā)揮益生作用的前提，也是細(xì)菌與宿主相互作用的第1步［18-19］。Caco-2細(xì)胞是體外培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞，來(lái)源于人結(jié)腸腺癌細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時(shí)，可自發(fā)進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生化學(xué)上的分化，其結(jié)構(gòu)、形態(tài)學(xué)、標(biāo)志酶的功能表達(dá)與腸上皮細(xì)胞類似，表現(xiàn)出成熟的腸上皮細(xì)胞的特性［20］，現(xiàn)普遍以Caco-2細(xì)胞為模型進(jìn)行體外模擬試驗(yàn)，并以此來(lái)近似反映益生菌在體內(nèi)腸黏膜的黏附特性［21-24］。郭彤等［25］研究表明，大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌均對(duì)Caco-2細(xì)胞有很強(qiáng)的黏附性。因此，阻止大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌黏附是抵抗其入侵的重要途徑之一。本研究表明，在競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)、排斥試驗(yàn)和置換試驗(yàn)中，納豆芽孢桿菌B4對(duì)大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌黏附Caco-2細(xì)胞的黏附率無(wú)顯著影響，對(duì)大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌黏附Caco-2細(xì)胞未顯示顯著的阻斷作用。Matija?ic＇等［26］研究表明，格氏乳桿菌能通過(guò)排斥作用和競(jìng)爭(zhēng)作用抑制大腸桿菌K88黏附Caco-2細(xì)胞，但不影響大腸桿菌K88對(duì)豬的空腸組織黏附能力。魏銀萍［27］研究表明，嗜酸乳桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和糞腸球菌能夠抑制大腸桿菌和沙門(mén)氏菌對(duì)HT-29細(xì)胞的黏附能力，但益生菌的黏附力大小并不能決定其抑制致病菌對(duì)HT-29細(xì)胞黏附作用的強(qiáng)弱，嗜酸乳桿菌的黏附能力比長(zhǎng)雙歧桿菌強(qiáng)，但前者對(duì)致病菌的黏附抑制作用卻不如后者。Nissena等［18］研究同樣表明，黏附能力高的益生菌不一定具有更強(qiáng)的抵抗致病菌的作用。Wang等［28］研究發(fā)現(xiàn)，在腸道定植能力弱的乳酸菌，同樣可以減少腸道大腸桿菌的數(shù)量?？梢?jiàn)，益生菌的黏附能力及其對(duì)致病菌的抗黏附作用并不是其抑制致病菌生長(zhǎng)的必要條件，益生菌抑制腸道病原菌的機(jī)理比較復(fù)雜，涉及黏附、占位以外的其他機(jī)理，這些機(jī)理有待于我們進(jìn)一步討論。

3.3 納豆芽孢桿菌B4對(duì)Caco-2細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響

細(xì)胞因子在免疫應(yīng)答與免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用［29］。受細(xì)菌或者病毒刺激的組織或細(xì)胞可通過(guò)釋放細(xì)胞因子來(lái)活化局部免疫和系統(tǒng)免疫，并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的類型和強(qiáng)度。根據(jù)細(xì)胞因子和趨化因子在炎癥反應(yīng)過(guò)程中的不同作用，可將細(xì)胞因子分為促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子2類，前者包括白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IL-6、白細(xì)胞介素-12(IL-12)、干擾素 -γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子 -α(TNF-α)以及趨化因子IL-8等，主要介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生和加劇，提高機(jī)體抗感染能力的作用。而白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素 -5(IL-5)、IL-10、白細(xì)胞介素-13(IL-13)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 -β(TGF-β)屬于后者，具有抑制和消除炎癥反應(yīng)，維持免疫平衡的作用［30］。

APRIL是TNF家族新成員，具有增強(qiáng)抵抗外來(lái)抗原、毒素以及病原微生物入侵的作用。He等［31］和 Macpherson 等［32］研究發(fā)現(xiàn)，APRIL 是活化腸黏膜免疫應(yīng)答中重要的促炎細(xì)胞因子，在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)，受細(xì)菌抗原(整個(gè)菌體內(nèi)、毒素或鞭毛)刺激的Caco-2細(xì)胞則表達(dá) APRIL。本研究結(jié)果顯示，納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌均可極顯著提高Caco-2細(xì)胞分泌APRIL的含量，而未受刺激的Caco-2細(xì)胞則低表達(dá)APRIL。因此，納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌均能刺激Caco-2細(xì)胞分泌APRIL，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗外來(lái)抗原、毒素以及病原微生物的入侵。Hosoi等［33］研究表明，不同試驗(yàn)條件會(huì)影響納豆芽孢桿菌和大腸桿菌刺激Caco-2細(xì)胞分泌IL-6和IL-8。但本試驗(yàn)未能發(fā)現(xiàn)納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌刺激Caco-2細(xì)胞分泌IL-6和IL-8，可能是由于菌株特異性或試驗(yàn)條件不一樣引起的?？寡准?xì)胞因子IL-10能夠抑制炎癥應(yīng)答，使免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)向耐受模式，從而能有效控制或治療嚴(yán)重的炎癥疾病，具有限制腸上皮細(xì)胞對(duì)致病菌的免疫應(yīng)答和維持對(duì)共生細(xì)菌穩(wěn)態(tài)的作用［34］。本試驗(yàn)表明，納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌均可極顯著抑制Caco-2細(xì)胞分泌IL-10，從而進(jìn)一步增強(qiáng)Caco-2細(xì)胞的促炎反應(yīng)。因此，納豆芽孢桿菌B4、大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌對(duì)促炎細(xì)胞因子IL-6和IL-8含量無(wú)顯著影響，但能通過(guò)顯著提高促炎細(xì)胞因子APRIL的含量活化Caco-2細(xì)胞促炎反應(yīng)，同時(shí)能通過(guò)抑制Caco-2細(xì)胞分泌IL-10，進(jìn)一步增強(qiáng)Caco-2細(xì)胞的促炎反應(yīng)。

4 結(jié)論

①納豆芽孢桿菌B4對(duì)Caco-2細(xì)胞無(wú)顯著毒害作用，具有安全性。

②納豆芽孢桿菌B4對(duì)大腸桿菌K88和霍亂沙門(mén)氏菌黏附Caco-2細(xì)胞無(wú)阻斷作用。

③納豆芽孢桿菌B4能夠顯著誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子APRIL并抑制抗炎細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生，表明該芽孢桿菌可通過(guò)調(diào)節(jié)Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌發(fā)揮一定的免疫作用。

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