陳重軍1,2，朱為靜1，黃孝肖1，吳偉祥1,3

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厭氧氨氧化啟動過程Anammox菌富集規(guī)律和差異分析

陳重軍，朱為靜，黃孝肖，吳偉祥

1 浙江大學環(huán)境與資源學院，浙江杭州 310058 2 蘇州科技學院環(huán)境科學與工程學院，江蘇蘇州 215009 3 農(nóng)業(yè)部面源污染控制重點開放實驗室，浙江杭州 310058

陳重軍, 朱為靜, 黃孝肖, 等. 厭氧氨氧化啟動過程Anammox菌富集規(guī)律和差異分析. 生物工程學報, 2014, 30(6): 891?900.Chen CJ, Zhu WJ, Huang XX, et al.Enrichment regulation of anammox bacteria in the anammox start-up process. Chin J Biotech, 2014, 30(6): 891?900.

為明確厭氧氨氧化反應器啟動過程中Anammox菌的富集規(guī)律，采用熒光原位雜交 (FISH) 和實時熒光定量PCR (q-PCR) 分析技術，對未添加填料、添加多面空心球以及添加竹炭的3個UASB反應器厭氧氨氧化啟動過程中Anammox菌的增長規(guī)律進行分析。研究表明，Anammox菌的相對數(shù)量和絕對數(shù)量均隨著啟動時間呈逐漸遞增趨勢，在穩(wěn)定運行階段的第123天，無填料、多面空心球和竹炭反應器中Anammox菌分別占總細菌的23.3%、32.6%和43.7%，單位VSS污泥中Anammox菌16S rRNA基因拷貝數(shù)分別為(25.64±2.76)×10、(47.12±2.76)×10和(577.99±27.25)×10拷貝數(shù)gVSS。竹炭反應器中Anammox菌最大生長率和最短倍增時間分別為0.064 d¹和10.8 d，最大生長率分別是無填料和多面空心球反應器的1.78倍和1.88倍。因此，填料添加特別是竹炭的添加可極大地促進Anammox菌的選擇性生長和繁殖。FISH和q-PCR分析技術均適用于Anammox菌的富集規(guī)律研究，但因其檢測目標存在差異，造成兩者表征結果有所不同。

填料，厭氧氨氧化，厭氧氨氧化菌，熒光原位雜交，實時熒光定量PCR

厭氧氨氧化 (Anaerobic ammonium oxidation，Anammox) 結合亞硝化反應，相對于傳統(tǒng)的硝化/反硝化過程，可降低約50%的曝氣量和100%的有機碳源，在廢水脫氮過程中應用優(yōu)勢明顯。但Anammox菌生長慢 (最大比生長率僅0.002 7 h)、倍增時間長 (10–12 d)，導致厭氧氨氧化反應器啟動耗時長，一般都超過120 d，世界上第一個現(xiàn)場規(guī)模的厭氧氨氧化反應器啟動時間長達3.5年，該缺陷是限制厭氧氨氧化處理工藝大規(guī)模應用的最主要因素。因此，厭氧氨氧化啟動過程的研究一直是學者研究的熱點，以求尋找適宜Anammox菌快速增長的環(huán)境。近年來，研究認為減少厭氧氨氧化反應器污泥流失或延長污泥停留時間是實現(xiàn)厭氧氨氧化快速啟動的重要途徑之一，而添加填料是有效減少Anammox菌流失的方法，使Anammox菌附著于填料表面，促進Anammox菌的富集，所用填料包括無紡布、聚乙二醇凝膠、聚乙烯醇凝珠、海綿等。然而，大部分研究僅專注于填料添加對污泥流失率的影響，以及啟動成功后微生物群落結構差異 等，對反應器啟動過程中Anammox菌的富集趨勢和規(guī)律，以及填料添加是否會對Anammox菌選擇性生長繁殖方面還未有深入研究。

熒光原位雜交 (Fluorescencehybridization，F(xiàn)ISH) 是將結合了熒光分子的探針雜交于對應的靶染色體或染色質的位置，從而檢測特異性DNA序列的技術；而實時熒光定量PCR (Quantitation PCR，q-PCR) 分析技術，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析獲取原始模板拷貝數(shù)的方法。采用特定的引物，F(xiàn)ISH和q-PCR技術可以明確Anammox菌的分布比例與絕對數(shù)量，已經(jīng)初步應用于Anammox菌的分析和檢測，而在啟動過程Anammox菌的富集趨勢方面的研究還較少。本文擬采用FISH和q-PCR分析，定性并定量研究UASB反應器啟動厭氧氨氧化過程中Anammox菌的富集規(guī)律和變化趨勢，以期為Anammox的快速啟動提供理論和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 反應裝置

啟動裝置采用UASB反應器，有機玻璃制成，反應器上部直徑20 cm，下部直徑10 cm，高度1 m，高徑比10∶1，有效容積10.8 L，反應器上部設置三相分離器用于氣液固的高效分離，氣孔用水封以保證反應器內部嚴格缺氧，進水采用蠕動泵控制。反應器外部設置厚度為1 cm的保溫層，內加循環(huán)水，維持反應溫度為 (30±1) ℃，反應器用黑色塑料紙包扎避光。

1.2 啟動運行

采用3個相同的UASB反應器啟動厭氧氨氧化，反應器均接種某城市污水處理廠二沉池和某啤酒廠厭氧消化池混合污泥 (體積比1∶1)，污泥添加量64.8%，其中1號反應器未添加填料 (無填料反應器，CK)；2號反應器添加多面空心球填料 (直徑25 mm，比表面積460 mm，多面空心球反應器，SP)；3號反應器添加低溫竹炭 (直徑3–5 mm，比表面積2.5×10mm，竹炭反應器，BC)，兩種填料有效容積均為400 mL，占反應器有效容積的3.7%。進水氨氮和亞硝態(tài)氮濃度均為40 mg/L，采用連續(xù)流方式，水力停留時間為48 h。

在整個啟動過程中，第0、44、70、106和123天取各反應器中污泥或生物膜樣品，無填料反應器污泥經(jīng)過多點采樣混合作為該時段樣品，多面空心球和竹炭反應器分別采取各自填料表面的生物膜，混勻后作為該時段樣品，其中第0天為接種污泥。樣品及時放置于–70 ℃保存。

1.3 FISH分析方法

采用Amx368 (5′-CCT TTC GGG CAT TGC GAA-3′-CY3) 探針(由寶生物工程 (大連) 有限公司合成)，分析Anammox菌的分布特征。CY3熒光染料受激發(fā)后發(fā)出肉眼可見的紅光，因此FISH圖像紅色代表所有Anammox菌；而全細菌的檢測采用4,6-Diamidino-2-phenylin- dole (DAPI) 染色，DAPI是一種可以穿透細胞膜的熒光染料，呈藍色，雙重染色后可在顯微鏡的同一視野下觀察全細菌的豐度，因此FISH圖像藍色代表總細菌。通過FISH圖像不同顏色之間的差異，采用Matlab軟件統(tǒng)計分析Anammox菌占總細菌的比例，以闡明Anammox菌在啟動過程中的富集規(guī)律。

1.4 q-PCR分析

q-PCR分析采用Amx694F (5′-GGGGAGA GTGGAACTTCGG-3′) 和Amx960R (5′-GCTCC ACCGCTTGTGCGAGC-3′) 引物對，分別對污泥 (或生物膜) 樣品的Anammox菌基因拷貝數(shù)進行分析。利用SYBR-Green法進行熒光定量擴增，儀器為iQ5多重實時熒光定量PCR儀 (Bio-Rad，USA)，所用試劑為SYBRPremix Ex-TaqKit (TaKaRa)，質粒的提取采用常規(guī)質粒抽提試劑盒Plasmid Mini Kit (OMEGA)。樣品反應體系與標準曲線PCR體系相同，根據(jù)抽提質粒計算目的基因拷貝數(shù)，10倍系列稀釋 (10、10、10、10、10和10) 用作模板，制作標準曲線，根據(jù)標準曲線計算出未知樣品基因的表達量。

q-PCR具體反應控制過程如下：95.0 ℃預變性1 min；95.0 ℃變性10 s，59.3 ℃退火15 s (收集熒光信號)，72 ℃延伸15 s，39個循環(huán)；在72–95 ℃之間制備熔解曲線確定基因特異性，每升高0.5℃保持5 s。

1.5 Anammox菌倍增時間和生長率

對Anammox菌倍增時間和生長率的評估，是明晰Anammox菌在不同填料反應器中生長狀況和趨勢的主要指標。Anammox菌倍增時間和生長率計算主要依據(jù)式 (1) 和式 (2)：

(2)

其中，–：時間段；：Anammox菌濃度，拷貝數(shù)mL；：Anammox菌初始濃度，拷貝數(shù)mL；：生長率 (d)。

2 結果與分析

2.1 水質分析

經(jīng)過4個多月的運行，3個反應器均能成功啟動厭氧氨氧化反應，穩(wěn)定運行階段對氨氮和亞硝態(tài)氮的去除率在98%以上，無填料、多面空心球和竹炭反應器啟動時間分別為117 d、 97 d和85 d，啟動過程可明顯分為4個階段，即：1) Anammox菌活性遲滯階段：出水氨氮濃度高于進水，亞硝態(tài)氮沒有降低趨勢，該階段Anammox菌基本未表現(xiàn)出活性，且污泥中含有的氨氮得以釋放，造成出水氨氮高于進水，3個反應器分別耗時18 d、21 d和30 d。2) Anammox菌活性表現(xiàn)階段：出水氨氮低于進水并逐步降低，亞硝態(tài)氮有所降低，該階段Anammox菌緩慢表現(xiàn)出一定的活性，3個反應器分別耗時 54 d、40 d和25 d。3) Anammox菌活性提高階段：出水氨氮與亞硝態(tài)同步并快速下降，該階段Anammox菌表現(xiàn)出較強的活性，且活性快速增強，3個反應器分別耗時25 d、16 d和10 d。4) Anammox菌活性穩(wěn)定階段：氨氮和亞硝態(tài)氮同步去除，且兩者出水濃度均穩(wěn)定且低于1 mg/L，該階段Anammox菌活性較強，對底物去除效能基本穩(wěn)定，穩(wěn)定運行時間設定為20 d。

填料添加有助于促進厭氧氨氧化反應器的快速啟動，相對于無填料，竹炭反應器縮短啟動時間32 d，而多面空心球反應器縮短20 d，竹炭添加對厭氧氨氧化快速啟動非常有效，極大地縮短了啟動時間。

2.2 表觀現(xiàn)象分析

采用UASB反應器啟動厭氧氨氧化反應，啟動過程中，污泥顏色從暗黑色 (因厭氧消化污泥呈現(xiàn)深黑色) 變?yōu)榈S色，然后逐漸變?yōu)樽丶t色，且紅顏色逐漸加深，因厭氧氨氧化污泥含有豐富的細胞色素C而呈現(xiàn)紅色 (圖1)。其中無填料反應器富集污泥主要在底部，說明厭氧氨氧化污泥沉降性能較好；多面空心球反應器主要附著于多面空心球填料表面，形成的生物膜致密、均勻；竹炭反應器污泥部分隨竹炭懸浮于反應器上部，部分隨竹炭沉于反應器底部。相比多面空心球反應器，竹炭表面的生物膜不太均勻，但竹炭填料表面附著生物膜量大，幾乎覆蓋了整個表面。膜生物量大亦可能是造成厭氧氨氧化快速啟動的重要原因。

Seed sludge ?????Starting sludge?????Successful enrichment sludge

2.3 FISH技術結果分析

對3個反應器啟動過程污泥 (或生物膜) 樣品進行FISH分析，獲得的圖像見圖2。從FISH圖像可以看出，在反應器啟動成功后，樣品中含有大量的Anammox菌 (呈現(xiàn)紅色)，分布不規(guī)則，一般以團聚體形式存在。利用Matlab軟件對不同時間FISH圖像進行分析，根據(jù)不同顏色的像素數(shù)量進行定量計算Anammox菌相對于總細菌的比例，結果見圖3。FISH分析結果表明，無填料、多面空心球和竹炭反應器中，啟動階段Anammox菌的相對數(shù)量隨著時間呈逐漸遞增趨勢，變化趨勢與氨氮、亞硝態(tài)氮的去除規(guī)律基本相符。

3個反應器啟動過程中Anammox菌增長趨勢相類似，但也有所差異。第0–70天左右，是無填料反應器Anammox菌活性遲滯和表現(xiàn)階段，Anammox菌占總細菌的比例從5.7%緩慢上升至15.8%，而在70 d之后，Anammox菌活性得到提高，進入活性提高階段，但其占總細菌的比例只有較少上升，從15.8%上升至17.3%，可能是Anammox菌快速增長，但總細菌的基數(shù)較大，導致Anammox菌比例上升緩慢。進入穩(wěn)定階段后，Anammox菌占總細菌比例由17.3%迅速上升至23.3%，該過程中Anammox菌逐漸成熟，其他細菌因為底物的特異性和限制性大量死亡，造成Anammox菌的相對比例快速增加。多面空心球反應器Anammox菌的集聚情況與無填料反應器有所差異，Anammox菌聚集體較小，但分布較廣。在整個富集過程中，多面空心球反應器生物膜中Anammox菌占總細菌的比例緩慢上升，從5.7%升至32.6%，在Anammox菌活性遲滯階段上升速率較小，而在Anammox菌活性穩(wěn)定階段，相對比例上升速率較大，該變化趨勢跟無填料反應器較為一致。

圖2 Anammox菌在UASB反應器中的富集情況 (紅色代表Anammox菌，藍色代表DAPI)

圖3 FISH分析啟動過程中Anammox菌占總細菌的比例

竹炭反應器啟動時間85 d，明顯少于其他兩個反應器。從FISH分析圖像看，Anammox菌的上升趨勢與前兩個反應器一致。竹炭反應器中Anammox菌占總細菌的比例明顯高于其他兩個反應器，在初始啟動時相對比例為5.7%，在啟動成功后第123天時，相對比例達到43.7%，高于無填料反應器的23.3%和多面空心球反應器的32.6%，且富集趨勢最為特殊。Anammox菌活性遲滯階段，相對比例緩慢上升，與其他反應器一致，但在Anammox菌活性表現(xiàn)階段、提高階段和穩(wěn)定階段，Anammox菌快速上升，上升速率高于其他兩個反應器。在穩(wěn)定培養(yǎng)階段，Anammox菌在3個反應器中的變化趨勢相類似，均有較快的上升。

總的來說，本文中獲取的富集產(chǎn)物Anammox菌所占比例較低。López等富集培養(yǎng)Anammox菌，經(jīng)過1年多的富集和運行后，Anammox菌所占比例達到 (85.0±1.8)%，可能是高負荷長期運行造成富集效果較高。Wang等采用MBR和SBR反應器啟動厭氧氨氧化，啟動65 d和101 d后，Anammox菌分別占61.4%和76.9%，認為底物濃度差異是造成兩個反應器差異的主要原因。而朱月琪等采用較低氮負荷，進水氨氮約15 mg/L，亞硝態(tài)氮15–20 mg/L，在ABR反應器內啟動厭氧氨氧化，經(jīng)過4個月的馴化，四格室的Anammox菌占總生物量的百分比分別為7.6%、6.0%、18.1%和26.4%，均處在較低水平，說明Anammox菌的富集比率與氮素負荷密切相關。

2.4 q-PCR技術結果分析

由表1可知，無填料、多面空心球和竹炭反應器污泥 (或生物膜) Anammox菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)增長趨勢跟FISH技術分析結果基本一致。在厭氧氨氧化富集啟動過程中，單位VSS污泥 (或生物膜) 中Anammox菌16S rRNA基因拷貝數(shù)隨著富集時間的增加而逐步遞增。在第123天啟動成功的污泥中，無填料、多面空心球和竹炭反應器單位VSS污泥中Anammox菌16S rRNA基因拷貝數(shù)分別為(25.64±2.76)×10、(47.12±2.76)×10和(577.99±27.25)×10gVSS，竹炭反應器分別是無填料和多面空心球的22.5倍和12.3倍。從Anammox菌的基因拷貝數(shù)來看，竹炭添加有利于反應器中Anammox菌的富集，可能是造成反應器快速啟動的主要因素。

從q-PCR分析結果，并通過計算式 (1) 和式 (2)，計算得到表2的結果。竹炭反應器平均生長率和平均倍增時間分別為0.048 d和 14.5 d，而無填料反應器和多面空心球反應器分別為0.022 d和30.9 d，0.027 d和25.3 d。竹炭反應器Anammox菌的平均生長率是無填料和多面空心球反應器的2.18倍和1.78倍。而竹炭反應器Anammox菌最大生長率和最短倍增時間分別為0.064 d和10.8 d，而無填料反應器和多面空心球反應器分別為0.036 d和19.5 d，0.034 d和20.3 d。竹炭反應器Anammox菌的最大生長率是無填料和多面空心球反應器的1.78倍和1.88倍，最短倍增時間僅為無填料和多面空心球反應器的55%和53%。竹炭反應器內部Anammox菌較高的生長率造成倍增時間較短，從而促進了UASB反應器厭氧氨氧化的快速啟動。

竹炭添加促進Anammox菌的生長和繁殖，反應器Anammox菌最大生長率為0.064 d，比本文中無填料反應器 (0.036 d)、多面空心球反應器 (0.034 d) 和Hao等報道的0.029 d都高，跟Strous等采用SBR反應器富集Anammox菌所報道的0.065 d基本一致，但低于Isaka采用生物濾池富集Anammox菌所報道的0.38 d和Noophan等在SBR厭氧氨氧化反應器中發(fā)現(xiàn)的0.15 d。而竹炭反應器Anammox菌最短倍增時間為10.8 d，與目前學術界普遍接受的Anammox菌倍增時間(11 d)基本一致。

表1 三個反應器啟動過程中厭氧氨氧化污泥16S rRNA基因拷貝數(shù)

表2 三個反應器啟動過程中Anammox菌的生長率和倍增時間

2.5 FISH和q-PCR分析結果差異分析

從圖2和表1結果可知，F(xiàn)ISH和q-PCR分析都能表征厭氧氨氧化反應器Anammox菌的增長趨勢，分析結果存在共同點，無填料、多面空心球和竹炭反應器中Anammox菌的相對比例和絕對量的變化趨勢基本一致，隨著富集時間的增加呈現(xiàn)緩慢增長趨勢，且兩者結果均是竹炭反應器>多面空心球反應器>無填料反應器，推測這也是造成竹炭反應器啟動耗時短的主要原因。但從q-PCR結果來看，竹炭反應器的富集程度遠比FISH結果要高，在穩(wěn)定階段，竹炭反應器單位VSS污泥中Anammox菌16S rRNA基因拷貝數(shù)分別是無填料和多面空心球反應器的5.63倍和10.34倍，而FISH結果Anammox菌占總細菌的比例，竹炭反應器分別是無填料和多面空心球反應器的1.88倍和1.34倍。

但是，F(xiàn)ISH和q-PCR分析結果亦存在很大的不同，這主要是分析技術本身檢測目標的差異造成的。FISH分析技術采用熒光染色方法確定目標菌，而染色主要針對團聚體存在的目標菌，但大部分Anammox菌不以團聚體形式存在，而是以單獨個體獨立存在，這就導致FISH分析技術雖然能確定有效的Anammox菌并初步闡明Anammox菌占總細菌的比例，但不能決定其絕對數(shù)量，對Anammox菌的絕對數(shù)量特別是游離態(tài)的Anammox菌很難準確分析。因此，q-PCR技術被引入該領域，且被認為是能準確考究厭氧氨氧化啟動過程中功能型微生物變化趨勢的有效手段。q-PCR分析技術是在PCR快速擴增過程中，通過捕捉信號即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，因此該技術能準確捕捉擴增放大后的Anammox菌信號，覆蓋所有能夠響應的Anammox菌，涵蓋以團聚體及游離態(tài)存在的Anammox菌，比FISH分析技術更加靈敏和準確。填料的添加在一定程度上改變反應器內Anammox菌的形態(tài)和聚集方式，這也是造成啟動過程中FISH分析和q-PCR分析結果存在差異的主要成因。

因此，F(xiàn)ISH和q-PCR分析都能表征厭氧氨氧化反應器Anammox菌的增長趨勢，但在表征準確度上FISH低于q-PCR分析，但目前針對Anammox菌的探針、引物等的設計還有待進一步發(fā)展和完善，相信隨著人們對Anammox菌生理特性的日趨明晰，對厭氧氨氧化啟動過程中Anammox菌富集規(guī)律的探尋也會更加成熟。

3 結論

熒光原位雜交 (FISH) 和實時熒光定量PCR (q-PCR) 分析技術表明，Anammox菌相對數(shù)量和絕對數(shù)量均隨著啟動時間呈逐漸遞增趨勢，變化趨勢與底物的去除規(guī)律基本相符。在穩(wěn)定運行階段的第123天，無填料、多面空心球和竹炭反應器中Anammox菌分別占總細菌的23.3%、32.6%和43.7%，單位VSS污泥中Anammox菌16S rRNA基因拷貝數(shù)分別為(25.64±2.76)×10、(47.12±2.76)×10和(577.99± 27.25)×10拷貝數(shù)gVSS，Anammox菌最大生長率為0.064 d，最短倍增時間為10.8 d。填料添加特別是竹炭的添加可極大地促進Anammox菌的選擇性生長和繁殖，促成Anammox菌生長率高和倍增時間短，加速厭氧氨氧化UASB反應器的快速啟動。FISH和q-PCR分析技術均適用于Anammox菌的富集規(guī)律的研究，但因其檢測目標存在差異，造成兩者表征結果有所不同，在準確度上FISH低于q-PCR分析。

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(本文責編 郝麗芳)

Enrichment regulation of anammox bacteria in the anammox start-up process

Chongjun Chen, Weijing Zhu, Xiaoxiao Huang, and Weixiang Wu

1 College of Environmental and Resource Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang, China 2 School of Environmental Science and Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, Jiangsu, China 3 Ministry of Agriculture Key Laboratory of Non-point Source Pollution Control, Hangzhou 310058, Zhejiang, China

To study the enrichment regulation of anammox bacteria during the whole start-up process of anammox reaction, two reactors with addition of carries of Spherical Plastic (SP) and Bamboo Charcoal (BC) and one without carrier (CK) were used to start anammox reaction. Then FISH and q-PCR analyses for the growth of all anammox bacteria were conducted during the operational process. The results indicate that the number of anammox bacteria in all reactors increased with time during the whole start-up process, which was consistent with the removal rate of ammonium and nitrite. On day 123 of stable phase, the percent of anammox cells in the sludge of CK, SP and BC accounted for 23.3%, 32.6% and 43.7%, respectively. The number of anammox bacteria 16S rRNA gene copies was (25.64±2.76)×10, (47.12±2.76)×10and (577.99±27.25)×10copies gVSS in the sludge of CK, SP and BC, respectively. Carrier addition could dramatically increase enrichment of anammox bacteria. BC addition significantly increased the anammox bacteria number in the UASB reactor which resulted in the acceleration of the anammox start-up process. In addition, the max specific growth rate and the minimum doubling time were 0.064 dand 10.8 d in BC reactor. The max specific growth rate of anammox bacteria in BC reactor was 1.78 times and 1.88 times greater than that in CK and SP reactor, respectively. Therefore, the FISH and q-PCR analyses were suitable for determining the enrichment regulation of anammox bacteria during the start-up time, while a bit of differences in results existed between the two analytical methods due to the difference in analysis targets.

carrier, anaerobic ammonium qxidation, anammox bacteria, fluorescencein situ hybridization (FISH), quantitative PCR (q-PCR)

November 6, 2013; Accepted: December 16, 2013

China National Critical Project for Science and Technology on Water Pollution Prevention and Control (No. 2014ZX07101-12), Natural Science Funds of Suzhou University of Science and Technology (No. XKQ201303), Science and Technology Project of Jiangsu Construction Department (No. 2013ZD35).

Weixiang Wu. Tel/Fax:+86-571-88982020; E-mail: weixiang@zju.edu.cn

國家水體污染控制與治理科技重大專項(No. 2014ZX07101-12)，蘇州科技學院科研基金項目(No. XKQ201303), 江蘇省建設系統(tǒng)科技項目(No. 2013ZD35) 資助。