劉燕，彭海兵，王建輝，王銀環(huán)，張娜，李穎，朱麗艷，楊秀紅，張連元

(1.河北聯(lián)合大學基礎醫(yī)學院，唐山 063000;2.河北聯(lián)合大學冀唐學院，唐山 063300)

肢體缺血-再灌注(ischemia-reperfusion，I-R)是臨床常見的病理過程。肺是一個高灌注的器官，全身靜脈血在肺毛細血管被動脈化，因此，在肢體I-R造成的全身炎癥反應中肺組織容易受累[1]。內(nèi)皮素(endothelin，ET)-1是一種有效的血管收縮劑，肺內(nèi)血管和氣管平滑肌尤其是肺動脈含有極多ET-1受體。ET-1存在ETA和ETB兩種受體。BQ123是由5個氨基酸組成的環(huán)五肽，是特異性ETA受體阻斷劑，可以直接阻斷ETA受體活性，對ETB受體幾乎無作用，具有高特異性、高親和力和水溶性的特點，能有效抑制ET引起的升壓效應。筆者探討肢體I-R后肺損傷發(fā)生的可能機制以及BQ123對其影響，為臨床防治肢體I-R后肺損傷提供科學的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級雄性斯波雷格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠30 只，體質(zhì)量 200 ～250 g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供，合格證號:SCXK(冀)2009-0017;使用許可證號:SYXK(冀)2010-0038。

1.2 儀器 美國產(chǎn)Scotsman AF30制冰機，Axiovert 200蔡司光學儀器購于上海，美國產(chǎn)Sigma-2M/ETM低溫高速離心機。

1.3 試劑與試藥 丙二醛(malondialdehyde，MDA)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、P-選擇素試劑盒購于南京建成生物工程研究所;ET-1試劑盒購于解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放射免疫研究所;Fas、Bcl-2、Caspase-3及原位末端標記(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)試劑盒購于北京中山生物試劑公司;BQ123購于美國Sigma公司。

1.4 模型制備與分組 將實驗大鼠隨機分為I-R組、BQ123組和對照組，每組10只。I-R組:采用止血帶法制作I-R模型，用橡皮圈環(huán)繞結扎大鼠雙后肢根部，并經(jīng)激光多普勒血流儀監(jiān)測并證實血流被阻斷，4 h后松解橡皮帶恢復血流灌注，再經(jīng)過4 h后放血處死動物;BQ123組:操作同I-R組，松帶前15 min經(jīng)頸外靜脈滴注BQ123溶液7 μg·kg－1;I-R組和對照組均于松帶前15 min經(jīng)頸外靜脈滴注0.9%氯化鈉溶液4 mL·kg－1。

1.5 指標觀察 經(jīng)腹主動脈放血致死動物后即刻取肺組織，液氮速凍，－70℃儲藏備用。稱取凍存的肺組織200 mg，移入裝有冰冷0.9%氯化鈉溶液2 mL的勻漿管中，冰浴條件下制備肺組織勻漿。用放射免疫法測定ET-1，采用生物化學法測定MPO、MDA，采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法測定P-選擇素的含量。取肺組織經(jīng)1%中性甲醛固定、包埋、切片，采用免疫組織化學方法檢測Fas、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達情況。采用TUNEL法測定肺細胞凋亡。采用BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)對各組大鼠的肺組織切片進行分析，每個實驗組分別隨機選取6張切片，得出平均吸光度值(A)。每張切片計算6個高倍視野下的凋亡細胞數(shù)和陰性細胞數(shù)，并計算凋亡細胞百分率。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0版統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間均值采用單因素方差分析及其兩兩比較SNK-q檢驗進行統(tǒng)計學處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺組織 ET-1、MPO、MDA和 P-選擇素值的變化I-R組與對照組比較，肺組織ET-1、MPO、MDA和P-選擇素含量均顯著升高(均P＜0.01);BQ123組與IR組比較，ET-1、MPO、MDA和 P-選擇素均明顯下降，但仍高于對照組(均P＜0.01)，見表1。

2.2 肺組織Fas、Bcl-2、Caspase-3和細胞凋亡率的變化 對照組肺支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、肺小血管壁Fas、Bcl-2、Caspase-3表達弱陽性;I-R組較對照組肺組織Fas、Bcl-2 Caspase-3表達明顯上調(diào);BQ123組肺組織Caspase-3、Fas的表達較I-R組明顯減少，而Bcl-2表達明顯增強。見表2。TUNEL染色顯示，凋亡細胞核呈棕黃色或深褐色，以肺血管內(nèi)皮細胞、支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞為主。對照組凋亡細胞數(shù)稀少，I-R組與對照組比較，凋亡細胞數(shù)明顯增多。BQ123組與I-R組比較，凋亡細胞數(shù)減少。見圖1。

表13 組大鼠ET-1、MPO、MDA和P-選擇素的含量比較Tab.1 Comparison of the content of ET-1，MPO，MDA and P selection among three groups of rats ±s

表13 組大鼠ET-1、MPO、MDA和P-選擇素的含量比較Tab.1 Comparison of the content of ET-1，MPO，MDA and P selection among three groups of rats ±s

與對照組比較，*1P ＜0.01;與 I-R組比較，*2P ＜0.01Compared with control group，*1P ＜0.01;compared with I-R group，*2P ＜0.01

組別 大鼠/只ET-1/(pg·mL－1)MPO/(U·g－1)MDA/(nmol·mg－1)P-選擇素/(ng·mL－1)對照組 10 205.78 ±51.78 1.61 ±0.25 1.22 ±0.26 10.47 ±1.26 I-R 組 10 362.47 ±15.23*1 2.58 ±0.30*1 2.19 ±0.22*1 16.09 ±2.07*1 BQ123 組 10 301.08 ±35.21*1*2 2.18 ±0.13*1*2 1.74 ±0.30*1*2 12.51 ±1.65*1*2

表2 3組大鼠肺組織Fas、Bcl-2、Caspase-3吸光度和細胞凋亡率比較Tab.2 Comparison of the absorbance of Fas，Bcl-2，Caspase-3 and apoptosis among three groups of rats ±s

表2 3組大鼠肺組織Fas、Bcl-2、Caspase-3吸光度和細胞凋亡率比較Tab.2 Comparison of the absorbance of Fas，Bcl-2，Caspase-3 and apoptosis among three groups of rats ±s

與對照組比較，*1P ＜0.01;與 I-R組比較，*2P ＜0.01Compared with control group，*1P ＜0.01;compared with I-R group，*2P ＜0.01

/%對照組 10 0.095 ±0.002 0.100 ±0.001 0.095 ±0.003 4.17組別 大鼠/只 Fas Bcl-2 Caspase-3 細胞凋亡率±1.47 I-R 組 10 0.294 ±0.003*1 0.108 ±0.005*1 0.174 ±0.003*1 18.83 ±2.86*1 BQ123 組 10 0.115 ±0.007*1*2 0.128 ±0.005*1*2 0.159 ±0.006*1*2 10.67 ±2.16*1*2

3 討論

各種組織來源的內(nèi)皮細胞均可產(chǎn)生ET-1。ET-1可增強中性粒細胞、單核細胞的趨化，刺激白細胞釋放炎性遞質(zhì)，促進氧自由基的產(chǎn)生[2-3]。P-選擇素屬于選擇素家族一員，其表達于活化的血小板和組織內(nèi)皮表面，是介導白細胞游出血管的主要黏附因子之一，在炎癥中起重要的作用。肢體I-R后內(nèi)皮細胞功能受損產(chǎn)生的ET-1、氧自由基等均可刺激肺內(nèi)皮細胞表達P-選擇素。本研究結果顯示，再灌注后4 h，肺組織ET-1的含量升高，同時P-選擇素含量明顯增多，這為中性粒細胞在肺組織浸潤、聚集提供了條件，在一定程度上使得中性粒細胞與肺血管壁接觸增多。肺組織MPO含量增多，進一步說明組織中性粒細胞增多。MDA含量上升，提示肺組織氧化損傷加重。BQ123可以阻斷ET-1與ETA受體結合，幾乎無抑制ET-1結合ETB受體的作用。文獻報道ETB受體可以清除循環(huán)中的ET[4]。本實驗觀察到BQ123組肺組織ET-1含量下降，可能與上述原因有關。BQ123組較 I-R組肺組織 P-選擇素、MPO和MDA含量均明顯減少，說明ETA受體阻斷劑BQ123可抑制中性粒細胞在肺內(nèi)的黏附、聚集，從而減少了后續(xù)炎癥遞質(zhì)的大量釋放，減輕肺組織氧化損傷。

研究表明，多種臟器在發(fā)生I-R損傷時會出現(xiàn)細胞凋亡，細胞凋亡導致的細胞丟失可導致肺功能受損[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，I-R組TUNEL染色顯示肺泡上皮細胞、肺血管內(nèi)皮細胞及支氣管上皮細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，肺凋亡細胞百分率增大，提示細胞凋亡參與了肢體I-R后肺損傷。目前認為，死亡受體通路、線粒體通路是細胞凋亡發(fā)生的不同途徑[6]。死亡受體途徑可通過Fas/FasL誘導，F(xiàn)as與FasL受體結合轉導凋亡信號進入靶細胞并激活Caspase級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡。Bcl-2是線粒體凋亡通路成員，是重要的抗細胞凋亡基因[7]。兩條通路最終都通過激活Caspase-3執(zhí)行凋亡。結果顯示，BQ123組較I-R組，抑制凋亡的Bcl-2蛋白表達明顯升高，而促進凋亡的Fas、Caspase-3蛋白表達降低，這與細胞凋亡情況相一致，提示BQ123減輕了大鼠肢體I-R后肺細胞凋亡。

綜上所述，ETA受體阻斷劑BQ123可降低中性粒細胞在肺組織的聚集，抑制大鼠肢體I-R后肺細胞凋亡相關蛋白的表達，對肺組織產(chǎn)生保護作用。

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