高 玟 陳艷紅 劉志良 羅慶豐 黃傳生 涂 侃

乳腺癌是我國婦女高發(fā)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占婦女腫瘤的31%。近年來針對HER-2表達的靶向治療方案是主要其輔助治療，是近期乳腺癌規(guī)范治療中的研究熱點[1]。應用免疫組化法檢測該腫瘤患者標本的CerbB-2蛋白表達情況，是乳腺癌HER-2基因表達重要篩查方法，探索出恒溫冷凍切片后樣本進行檢測CerbB-2蛋白表達是否可行，為CerbB-2蛋白檢測樣本的規(guī)范化處理和乳腺癌的手術后規(guī)范的輔助治療作出有益的探索。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集我院2008年10月-2011年8月期間收治的乳腺浸潤性導管癌患者130例，均為女性，年齡37～66歲，平均年齡56.7歲。

1.2 方法

1.2.1 恒溫快速冷凍切片方法 取5 mm厚度組織，加入OCT包埋劑，置入冰凍恒溫快速冷凍切片機冷凍5 min，待OCT包埋劑變白硬化后，按5 μm厚度切片，裱在防脫玻璃片，行HE染色，封片，閱片。

1.2.2 CerbB-2蛋白檢測 采用MaxvisionTM免疫組化法，按照免疫組化試劑盒的操作說明進行。CerbB-2蛋白為工作液，具體步驟：①4 μm連續(xù)切片，裱于涂有APES的載玻片上，70 ℃烤片2 h;②二甲苯脫蠟，梯度酒精入水；③3%過氧化氫室溫孵育30 min，消除內源性過氧化物酶；④抗原修復：切片浸于pH 6.0檸檬酸溶液中，電飯鍋中煮沸5 min，保溫10 min，自然冷卻；⑤PBS洗,3 min×2次；⑥加入已知 CerbB-2蛋白抗體，4 ℃冰箱12 h；⑦復溫，PBS洗去一抗3 min×2次；⑧滴加Maxvision試劑，室溫作用1 h；⑨PBS洗3 min×2次；⑩DAB光鏡下顯色，蘇木精復染，封片[1]。光鏡下觀察CerbB-2蛋白在乳腺癌組織中表達。陽性對照：已知 CerbB-2蛋白強陽性乳腺癌組織切片；陰性對照：已知 CerbB-2蛋白陰性乳腺癌組織切片和PBS代替一抗染色切片。

1.2.3 結果判斷 細胞膜呈棕黃色顆粒沉著者為CerbB-2蛋白陽性。根據著色強度及著色癌細胞比例將染色結果分為-、+、++和+++級：無顯色為-，任何比例的浸潤性癌細胞呈現(xiàn)微弱、不完整的細胞膜著色為+，浸潤性癌細胞>10%呈現(xiàn)弱至中等程度、完整但不均勻的細胞膜棕黃色著色或浸潤性癌細胞<30%呈現(xiàn)強且完整細胞膜棕褐色著色為++，浸潤性癌細胞>30%呈現(xiàn)強且完整細胞膜棕褐色著色為+++。

1.3 閱片

在普通光學顯微鏡下，由兩名經驗豐富的病理科醫(yī)師對冷凍切片后對應的組織和剩余組織常規(guī)切片，的免疫組化切片進行單獨雙盲閱片,記錄診斷結果，按配對資料比較兩種方法的一致性。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，采用配對資料χ2檢驗和一致性檢驗分析。

2 結果

130例浸潤性導管癌冷凍組織對應樣本中42例不表達CerbB-2,33例CerbB-2 表達+，34例CerbB-2 表達++，21例CerbB-2表達 +++;剩余組織常規(guī)切片樣本中56例CerbB-2表達陰性,50例CerbB-2 表達+，19例CerbB-2 表達++，5例CerbB-2表達+++;兩組標記結果比較具有顯著性差異(χ2=134.04,P<0.01)，而且兩組CerbB-2陽性表達結果一致性較差(kappa值=0.39，P>0.05),見表1。

3 討論

乳腺癌靶向治療是近期發(fā)展較快且有成效的治療手段，CerbB-2是表皮生長因子受體家族成員之一，定位于人17染色體q21區(qū)帶，是185kD的跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，參與多種信號的傳導，已有臨床研究顯示[2]：對于CerbB-2受體過表達的乳腺癌患者，采用1種人源化的單克隆抗體類藥物Herceptin是安全有效的藥物，陰性患者Herceptin無效，表明CerbB-2是乳腺癌靶向治療的有效靶點，但是靶向治療藥物常常費用昂貴，因此準確檢測乳腺癌CerbB-2表達情況對于乳腺癌術后規(guī)范的輔助治療具有重要意義。

表1 130例乳腺癌組織中 CerbB-2蛋白表達情況/例

恒溫快速冷凍切片技術能快速明確各種腫瘤患者的病理診斷和分級，特別是在手術過程中尤為重要[3]，在乳腺癌患者中顯著提高了診斷準確率和明確的陰性手術切緣，在乳腺癌患者規(guī)范化的治療中起到重要作用[4]，該技術得到廣泛應用，但是目前沒有發(fā)現(xiàn)有關恒溫冷凍切片對于患者CerbB-2蛋白檢測影響的研究，我們選擇了130例乳腺浸潤性導管癌患者，對恒溫冷凍切片后對應同一組織進行石蠟切片CerbB-2蛋白表達檢測，檢測結果陽性率為3.80%。同時對該患者剩余組織的石蠟切片進行CerbB-2蛋白檢測，陽性結果16.20%，兩組結果差異比較具有非常顯著統(tǒng)計學意義，在恒溫冷凍切片后對應組織的石蠟切片中發(fā)現(xiàn)CerbB-2蛋白出現(xiàn)彌散，定位不準確，陽性強度減弱等現(xiàn)象，因為CerbB-2蛋白是1種跨膜糖蛋白，在快速冷凍情況下，細胞的細胞膜因溫度的短期內激烈的改變產生跨膜結構破壞，導致細胞膜結構的破壞，從而影響陽性表達定位，細胞質內出現(xiàn)陽性顆粒。研究表明恒溫冷凍切片對乳腺癌Cerb-2表達影響較大，減低Cerb-2陽性表達，因此工作中應該盡量避免使用恒溫冷凍切片后的同一樣本進行乳腺癌Cerb-2表達檢測，以免誤導治療，減少患者不必要的醫(yī)療負擔和浪費。

隨著乳腺癌患者規(guī)范化治療的進展，恒溫冷凍切片技術應用和Her-2蛋白的檢測將會越來越廣泛，本研究發(fā)現(xiàn)恒溫快速冷凍切片技術會減低免疫組化法檢測Her-2蛋白的陽性表達，對于免疫組化法檢測前檢測樣本的標準化處理流程具有重要意義，同時有必要進一步研究恒溫快冷凍切片技術對FISH法檢測乳腺癌Her-2基因的影響，更為準確的提供乳腺癌相關蛋白和基因檢測前樣本處理的規(guī)范化流程[5]。

[1] Kreancs L,Kreancs T,Stelkovics E，et al.Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections〔J〕.Methods Mol Biol,2010,588:103-119.

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