魏 凱 李 悅 張苗苗 王 博 崔亞利

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150081)

131I是治療分化型甲狀腺癌最特異、最有效的放射性藥物，可以被甲狀腺組織高選擇性地吸收，療效確切。然而，在分化型甲狀腺癌的病變進(jìn)展過程中，細(xì)胞可以出現(xiàn)失分化現(xiàn)象。研究指出，在分化型甲狀腺癌轉(zhuǎn)移的患者中，約有1/3可能發(fā)生失分化〔1〕。失分化使患者攝碘能力減低或喪失，使131I治療無效，成為困擾醫(yī)生及患者亟待解決的問題。槲皮素可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，使失分化及未分化甲狀腺癌再分化，且對放療具有增敏作用。本文擬用131I標(biāo)記槲皮素，以期尋找一種新的靶向藥物可以提高甲狀腺癌內(nèi)放療的療效，減少失分化的發(fā)生，且達(dá)到對失分化及未分化的甲狀腺癌行再分化治療的目的。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與細(xì)胞 槲皮素二水合物(美國Sigma 公司產(chǎn)品)，Na131I溶液(成都中核高通同位素股份有限公司)；氯胺T(Ch-T)，焦亞硫酸鈉，甲醇，去離子水，玻板，氧化鋁，微-晶纖維素，磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自北京化學(xué)試劑公司；甲狀腺癌細(xì)胞FTC-133/8505C,美國實(shí)驗室惠贈。

1.1.2儀器 CRC-15BETA 放射性活度計(美國 Capintec 公司)，SN-695B 型放免 γ 測量儀(上海核所日環(huán)光電儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(美國 Thermo 公司)，離心機(jī)(德國 Hettich Zentrifugen公司)，電子細(xì)胞數(shù)計數(shù)器(美國Beckman Coulter公司)，電子分析天平(德國Sartorius公司)， 薄層放射性掃描儀(瑞士CAMAG公司)。

1.2方法

1.2.1131I標(biāo)記槲皮素的制備 應(yīng)用氯胺T法對槲皮素行131I標(biāo)記，取50 μg槲皮素溶于10 μl酸性甲醇中，待槲皮素完全溶解后與20 mBq Na131I溶液混合，然后加入Ch-T，充分混勻，室溫靜置30 min后用偏重亞硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，標(biāo)記完成。在對131I標(biāo)記槲皮素的方法學(xué)探討中，改變標(biāo)記條件，選定5個影響標(biāo)記結(jié)果的重要因素并分別選取不同的水平：氯胺T用量5～45 μg；槲皮素用量40～140 μg：反應(yīng)體系的pH 2.0～11.0；反應(yīng)溫度4℃～37℃；反應(yīng)時間1～30 min，分別測定標(biāo)記率。經(jīng)3次水洗，131I-Qu從游離131I中被純化。離心分離后，游離131I從水溶液中去除。平行試驗中，在同等條件下，樣品中沒有Ch-T被用于131I與槲皮素的任何反應(yīng)中，作為空白對照組。

1.2.2質(zhì)量控制 應(yīng)用兩種不同的薄層色譜法(TCL)作質(zhì)量控制：一種是TCL氧化鋁片(F254中性)，用甲醇作為流動相，另一種是TLC纖維素薄片，用甲醇-乙醚(20～80 V/V %)作為流動相。

1.2.3體外穩(wěn)定性測定 將標(biāo)記物投入到1 ml人新鮮血清中，置于37℃水浴箱中溫育，分別測定標(biāo)記物標(biāo)記后24 h內(nèi)1、2、4、8、24 h不同時間點(diǎn)的放化純度。

1.2.4131I-Qu的結(jié)合率測定 采用細(xì)胞免疫結(jié)合率測定法測定131I-Qu的免疫活性。取對數(shù)生長期的甲狀腺癌細(xì)胞(FTC-133/8505C)，制成 1×106、5×106、1×107、5×107、1×108/ml的細(xì)胞懸液，取0.05 ml置于微量離心管，4個復(fù)管。加入20 μl經(jīng)PBS稀釋的131I-Qu，混勻后4℃放置4 h，γ測量儀測總放射性活性T，然后低溫離心5 min(2 000 r/min)，磷PBS洗3次，測定沉淀細(xì)胞的放射性活性B，計算結(jié)合率(免疫結(jié)合率=B/T×100)。對照組中加入游離的131I，其余步驟同上。

2 結(jié) 果

2.1131I標(biāo)記槲皮素的標(biāo)記條件 對照組未加入Ch-T純化，沉淀物中未檢測到放射性活性。

2.1.1Ch-T用量對標(biāo)記率的影響 在固定槲皮素用量100 μg，pH6.0，室溫和反應(yīng)時間為5 min的情況下，131I-Qu的標(biāo)記率隨Ch-T用量增加而增加；當(dāng)Ch-T為25 μg時，標(biāo)記率可達(dá)(98.3±0.4)%，放化純可達(dá)(98.8±0.3)%。但當(dāng)Ch-T用量增加至30 μg時，標(biāo)記率下降，為(85.4+0.5)%，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=42.7，P<0.01)。見圖1。

2.1.2槲皮素用量對標(biāo)記率的影響 在Ch-T用量25 μg，pH6.0，室溫條件下反應(yīng)5 min，當(dāng)槲皮素量為40～80 μg時，隨著槲皮素用量的增加，標(biāo)記率亦在增加；當(dāng)槲皮素用量達(dá)到約82 μg時，標(biāo)記率幾乎已經(jīng)達(dá)到最高。但為了能得到較高的標(biāo)記率，因此，本實(shí)驗中槲皮素用量為100 μg。見圖2。

2.1.3pH值對標(biāo)記率的影響 在固定Ch-T用量25 μg，槲皮素用量100 μg，室溫條件下反應(yīng)5 min，當(dāng)pH6.0時，得到了最高的標(biāo)記率，當(dāng)pH<6.0時標(biāo)記率隨著pH值的減小明顯下降，當(dāng)pH>6.0時標(biāo)記率隨著pH值的升高亦明顯下降。見圖3。

圖1 Ch-T用量對標(biāo)記率的影響

圖2 槲皮素用量對標(biāo)記率的影響

圖3 pH值對標(biāo)記率的影響

2.1.4反應(yīng)時間及反應(yīng)溫度對標(biāo)記率的影響 將反應(yīng)時間設(shè)為1、5、10 min，標(biāo)記率分別為(98.1±0.6)%、(98.2±0.2)%、(98.16±0.3)%，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.25，P>0.05)。將反應(yīng)溫度設(shè)定為4℃、室溫37℃時，其標(biāo)記率分別為(97.5±1.2)%、(98.3±1.0)%、(97.6±1.4)%，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.06，P>0.05)。

2.2質(zhì)量控制 應(yīng)用兩個薄層色譜系統(tǒng)，薄層色譜中應(yīng)用氧化鋁(Al2O3)和纖維素作為固定相，為131I-Qu和游離131I執(zhí)行質(zhì)量控制,效果良好。圖4為一個典型的結(jié)果，應(yīng)用兩個薄層系統(tǒng)在125I -Q (A和C)和空白反應(yīng)(B和D)。

A：應(yīng)用TCL，Al2O3，第一峰為131I-Qu，第二峰為游離131I；B：應(yīng)用TCL，Al2O3，出現(xiàn)鋒為游離131I；C：應(yīng)用TCL，纖維素，第一峰為游離131I，第二峰為131I-Qu；D：應(yīng)用TCL，纖維素，第一峰為游離131I

2.3131I標(biāo)記槲皮素的體外穩(wěn)定性131I-Qu在 37℃條件下放置，見圖標(biāo)記物于1、2、4、8、24 h放化純度分別為96.2%，95.9%、94.6%、93.3%、90.6%，測得放射化學(xué)純度隨時間逐漸呈緩慢下降趨勢，至 24 h時所測值仍大于90%，說明131I-Qu體外穩(wěn)定性良好。

2.4131I-Qu的結(jié)合率測定131I-Qu 的細(xì)胞結(jié)合率中 5×104、2.5×105、5×105個細(xì)胞組與 2.5×106、5×106個細(xì)胞組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，5×104、2.5×105、5×105個細(xì)胞組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，2.5×106、5×106個細(xì)胞組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 131I-Qu與FTC-133/8505C細(xì)胞的結(jié)合率±s,n=3,%)

3 討 論

用放射性核素標(biāo)記配體(如腫瘤血管靶向性肽、抗體或小分子化合物等)作為示蹤劑，使之與高表達(dá)的受體分子結(jié)合，從而使腫瘤顯像并對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷〔2〕。此外，與單獨(dú)化療藥相比，將其與腫瘤導(dǎo)向治療藥物聯(lián)合，可以達(dá)到增強(qiáng)腫瘤治療療效、降低藥物毒性和不良反應(yīng)的目的〔3〕。

放射性核素131I早于1984年就開始運(yùn)用于導(dǎo)向治療研究，既可應(yīng)用于甲狀腺疾病的診斷及特異性靶向治療，還可應(yīng)用于抗體、配體和反義核苷酸等的標(biāo)記。本實(shí)驗利用放射性核素131I標(biāo)記，其優(yōu)勢在于：具有適宜的半衰期(8.02 d)；適宜的衰變能量；131I 釋放的β射線能量為 607 kev，其殺傷半徑大于50個細(xì)胞，可用于放射性核素內(nèi)照射治療；131I 還釋放能量為 364 kev的γ射線，可作為示蹤劑用于放射性核素顯像。

本實(shí)驗采用氯胺-T 法利用131I標(biāo)記槲皮素。標(biāo)記物分子結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，反應(yīng)溫和。標(biāo)記產(chǎn)物131I -Qu的標(biāo)記率較高，在37℃條件下其放射化學(xué)純度仍然大于90% ，表明131I -QU 結(jié)合較穩(wěn)固，脫碘不明顯，具有良好的穩(wěn)定性，有利于后期的實(shí)驗研究。

放射性131I標(biāo)記多肽的標(biāo)記率受到很多因素的影響，但多肽分子中酪氨酸殘基數(shù)目的多少、多肽分子中酪氨酸殘基暴露的程度是最主要的因素。此外，影響標(biāo)記反應(yīng)的因素還包括(1)放射性碘的選用〔4〕：應(yīng)選用新鮮的、比放射活度高的、無載體的、含還原劑量少的。(2)放射性碘與抗體用量的比例〔5〕：二者的比例會嚴(yán)重影響標(biāo)記結(jié)果，一般情況下不應(yīng)該投入過多的碘源，通常當(dāng)投入的碘量一定時，抗體用量越多，碘的利用率越高，但得到的標(biāo)記化合物比放射活度低；相反情況，抗體用量越少，那么碘的利用率則降低，但所得標(biāo)記化合物比放射性則高，比放射活度會隨此比值變化有較大的變動。(3)Ch-T的用量及碘化反應(yīng)時間〔4〕：早期用氯胺 T 法作碘化標(biāo)記時，一般Ch-T用量都比較大，致使嚴(yán)重毀傷了抗體結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。大量應(yīng)用氯胺 T 是無益于實(shí)驗的，其結(jié)果可能反而導(dǎo)致標(biāo)記化合物活性下降。當(dāng)然，也不能盲目減少Ch-T的用量，否則碘源中還原劑量過多，將會導(dǎo)致標(biāo)記實(shí)驗失敗。許多標(biāo)記試驗中可以采取延長反應(yīng)時間的方法提高標(biāo)記率，但是氯胺T碘化法中一定要嚴(yán)格控制反應(yīng)時間，反應(yīng)時間過長會導(dǎo)致標(biāo)記的多肽或抗體嚴(yán)重失活，理論上來講，碘化反應(yīng)時間通常在1 min，但是根據(jù)我們的實(shí)驗，5 min時反應(yīng)體系的標(biāo)記率較高，低于5 min時，所得的標(biāo)記率及放化純都不甚理想。(4)根據(jù)不同化合物的性質(zhì)決定多肽的pH值、酸、堿的反應(yīng)條件〔6〕，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間也是標(biāo)記率的重要影響因素，時間太短,不完整,標(biāo)記率很低；時間太長,容易破壞標(biāo)記物的生物活性。

薄層色譜法是一種微量、簡便、快速的分離方法，適用于微量樣品的分離、鑒定和制備。

槲皮素是一種天然黃酮，廣泛存在于植物的花、葉、果實(shí)中，生物學(xué)活性及藥理作用廣泛，具有抗氧化、有抗炎、降糖降壓、免疫調(diào)節(jié)等作用，并且可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔7〕。本課題組已經(jīng)證實(shí)〔8〕，在體內(nèi)外實(shí)驗中槲皮素均可以提高放療的敏感性,其機(jī)制可能與靶向作用于ATM介導(dǎo)的放療反應(yīng)通路有關(guān)。

本研究顯示，采用氯胺T法131I標(biāo)記槲皮素的方法是可行的，在最佳標(biāo)記條件下，其標(biāo)記率和放化純均>95%，方法簡單，克服了間接標(biāo)記需對槲皮素進(jìn)行化學(xué)修飾及對其功能基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)和去保護(hù)處理等不足，標(biāo)記產(chǎn)物體外穩(wěn)定性好，與細(xì)胞結(jié)合率較好。因此，131I -Qu是一種具有潛在應(yīng)用價值的靶向新型抗腫瘤治療藥物。

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