康戰(zhàn)方 高 軍 張 恬 印大中

(暨南大學附屬清遠醫(yī)院，廣東 清遠 511518)

金柚是蕓香科柑橘屬水果，為柚和桔的自然雜交種。中醫(yī)認為柚子具有化痰止咳、消食快膈、去胃中惡氣、解酒毒、長發(fā)潤燥以及治療孕婦食少、口淡等功效。現代醫(yī)學研究發(fā)現金柚中富含多種黃酮類化合物，具有抗炎、調節(jié)血糖血脂等功能，對預防和治療糖尿病、肥胖以及心腦血管方面的疾病有重要作用〔1，2〕。此外，根據衰老機制及抗衰老研究表明黃酮類化合物也具有免疫調節(jié)及抗氧化抗衰老功能〔3～5〕。但具體機制仍不是很清楚。本實驗利用哺乳動物報告基因系統(tǒng)對金柚提取物進行雌激素樣活性檢測，并鑒定其活性成分。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑與藥品 無病害、未完全成熟的金柚產自廣東梅州。Hela細胞來自中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院。DMEM無酚紅培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素購自 Hyclone公司。Lipofactemine 2000 購自 Invitrogen公司。Dual-GloTM熒光檢測試劑盒購自Promega 公司。質粒 pFR-Luci，Renilla Luciferase，ERα以及 ERβ(擴增人的 ERα或 ERβ的配體結合域并將其克隆到含有 Gal4-DNA結合域的真核表達質粒 p-CMV-BD中)均來自原中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院黃志偉研究員。細胞培養(yǎng)板購自 Corning Costar 公司。柚皮苷、柚皮素對照品由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.1.2主要儀器設備 SCL-10A vp 高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)。Forma 370 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific)。 VERITASTM Microplate Luminometer微孔板型發(fā)光檢測儀(Turner Biosystems)。

1.2方法

1.2.1金柚乙醇提取物的提取 先將柚子用水洗干凈后切片，經干燥碾磨得到粉末，再過40目篩后，每100 mg粉末加入95%的乙醇1 ml，超聲提取30 min后使用0.22 μm微孔濾膜過濾后用于細胞實驗以及 HPLC分析。

1.2.2HPLC分離 色譜柱為 Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫25℃；流動相為甲醇∶醋酸∶水(35∶2∶63)；流速為 1 ml/min；檢測波長 283 nm；進樣量為10 μl。

1.2.3細胞培養(yǎng) 人子宮癌細胞系Hela培養(yǎng)在無酚紅的DMEM培養(yǎng)基中，加入10%活性碳處理的胎牛血清及抗生素(青霉素100 U/mL，鏈霉素100 g/ml)，37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱濕潤培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次。

1.2.4ERα和 ERβ報告基因活性分析 處于對數生長期的Hela細胞以10 000個/孔傳于96孔細胞培養(yǎng)板中過夜培養(yǎng)，待細胞長至80%～90%滿時用于轉染實驗。主要過程：首先用優(yōu)化培養(yǎng)液MEM稀釋Lipofactemin 2000試劑(體積比1∶200)和相應質粒 DNA，5 min后將稀釋的脂質體和質粒DNA等體積混合，室溫放置20 min后加入96孔板(10 μl/孔)并輕輕搖勻。最終每孔的質粒濃度為 ERα或者 ERβ 25 ng/孔,pFR-Luci 50 ng/孔,Renilla Luciferase 3 ng/孔。細胞瞬時轉染質粒6 h后更新培養(yǎng)液并進行藥物處理，藥物處理24 h后根據Promega公司 Dual-GloTM 報告基因檢測試劑盒說明書測定細胞的熒光值，并以 Renilla Luciferase讀數進行校正。

2 結 果

2.1金柚提取物對ERα和ERβ報告基因活性的影響 根據預實驗〔6〕，我們發(fā)現5 nmol/L的雌二醇能完全激活ERα和ERβ，其中對ERα激活倍數約30～120倍，對 ERβ激活倍數約10～30倍，因此我們每次實驗都加入5 nmol/L的雌二醇作為陽性對照。金柚提取物分別稀釋十萬倍(1×)、萬倍(10×)和千倍(100×)時，對 ERα沒有激活作用，而10×和100×金柚提取物顯著提高了 ERβ的相對熒光值，但相比雌二醇的效果要小。見表1。

2.2HPLC分離單一成分對ERα和ERβ報告基因活性的影響

表1 金柚提取物對ERα和ERβ報告基因活性(相對熒光值)的影響±s)

首先用 HPLC分離出了7個主要成分，保留時間分別為12、14.8、17.2、18、19.5、21.5、23.5 min。通過濃縮凍干后再溶入10 μl的乙醇中，然后按1∶1 000稀釋至培養(yǎng)基中。如表2所示，所有成分對 ERα都沒有明顯的作用，而保留時間為14.8、23.5 min的兩個產物都對 ERβ有特異性的激活作用，其中產物23.5 min比產物14.8 min的激活作用強。

2.3通過紫外可見吸收曲線及標準品HPLC圖譜對活性產物鑒定 通過紫外可見吸收曲線發(fā)現14.8 min產物在283 nm處有最大吸收值，而23.5 min產物在288 nm處有最大吸收值。金柚中柚皮苷占總含量的80%以上。從 HPLC圖譜(圖1)可以看出14.8 min產物占主要部分，且紫外可見最大吸收值約在283 nm，和柚皮苷相符合；而紫外可見最大吸收值在288 nm和柚皮素相符合。通過和高純度的柚皮苷、柚皮素HPLC圖譜比較，發(fā)現保留時間為14.8 min和23.5 min的產物分別為柚皮苷和柚皮素。

2.4不同ER調節(jié)劑對ERα和ERβ的親和力比較 見表3。雌二醇和染料木苷能同時激活 ERα和 ERβ。5 nmol/L和0.5 nmol/L雌二醇能分別激活ERα和ERβ到最大水平；而染料木苷約10 μmol/L才能完全激活ERα，對ERβ的最大激活能力則在100～1 μmol/L。柚皮苷和柚皮素特異性的激活ERβ，其中柚皮苷親和力較弱，即使在100 μmol/L的高濃度下也只是部分激活(只有約15%的5 nmol/L雌二醇的熒光值)。而柚皮素對ERβ有較高的親和力，1 μmol/L濃度就能完全激活ERβ。所以對 ERβ的親和力為雌二醇>染料木苷>柚皮素>柚皮苷。

表2 HPLC分離金柚提取物單一化學成分對ERα和ERβ報告基因活性的影響±s)

圖1 金柚提取物、柚皮苷以及柚皮素 HPLC圖譜

指標 雌二醇(nmol/L) 染料木苷(μmol/L) 00.050.55500.010.1110ERα131±43179±16910±16116 252±1 00210 622±1 891168±40186±15471±10418 920±1 912ERβ174±17968±513 742±4 564 981±4064 204±3632 023±1003 729±2574 217±1 214 684 ±414指標 柚皮苷(μmol/L) 柚皮素(μmol/L) 00.111010000.0010.010.11 10ERα131±43113±4295±14120±7171±46486±19423±163979±727594±230340±143381±143ERβ174±17187±13320±41620±50697±45467±123371±921 119±2091 393±2874 327±7074 949±482

3 討 論

ER是介導雌激素發(fā)揮生物學功能的核激素受體家族成員，包括α和β兩個亞型(ERα和ERβ)。ER是配體依賴活化型的轉錄因子，主要通過其配體結合域與結構相異的小分子配體結合來調控靶基因的表達從而發(fā)揮生物學功能〔7〕。雌激素在人和哺乳動物的生殖系統(tǒng)、骨以及心血管系統(tǒng)發(fā)揮著重要的作用，和多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，如不同類型的癌癥(乳腺癌、卵巢癌、直腸癌、前列腺癌、宮頸癌等)、骨質疏松，神經退行性疾病、心血管疾病，肥胖及胰島素抵抗等〔8〕。盡管 ERα和 ERβ結構相似，但有著不同的生物學功能。ERα主要對生殖道及乳房的發(fā)育起調節(jié)作用，因為 ERα能促進細胞增殖；相反，ERβ表現為抗增殖作用〔9〕。ERβ基因敲除小鼠伴有前列腺肥大及骨髓增生性疾病〔10〕，在乳腺癌和結腸癌細胞中表達ERβ能抑制癌細胞增殖以及小鼠異種移植模型中腫瘤的形成，都能很好說明ERβ的抗增殖作用〔7〕。此外，ERβ還具有抗炎癥作用，這些都顯示ERβ特異性的激動劑有潛在的用作藥物治療及化學預防劑的可能〔7〕。

近來研究發(fā)現，人工合成雌激素具有致癌等一系列副作用，因此植物雌激素替代療法用于治療雌激素缺乏相關疾病的研究成為熱點〔11〕。植物雌激素是一類來源于植物，能結合哺乳動物和人類的ER并激活其信號通路的一類化合物。研究顯示植物雌激素能很好保護心血管系統(tǒng)，減少更年期婦女骨質流失以及絕經后的乳腺癌發(fā)生〔12〕。本研究表明，金柚提取物能特異性的激活 ERβ，其中最主要的活性成分為二氫黃酮類化合物柚皮素。金柚的抗炎癥、心血管保護等功能很可能是通過其激活ERβ信號通路。此外，金柚提取物是否能用于治療雌激素相關的疾病如骨質疏松、癌癥等以及在抗衰老方面的作用仍需進一步研究。

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