葉 俊 陳 敏 黃雪芳 劉承偉

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科，廣西 桂林 541004)

帕金森病(PD)是中老年人常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明，在早期如何通過(guò)一系列的干預(yù)手段預(yù)防或延緩PD的發(fā)生發(fā)展則具有重大意義。目前傾向于認(rèn)為氧化應(yīng)激水平的提高是PD重要的病理生理機(jī)制之一〔1～3〕。在氧化應(yīng)激時(shí)，與幼年動(dòng)物相比，老年動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的損傷更敏感，并且動(dòng)物暴氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)所導(dǎo)致的酶學(xué)改變與衰老時(shí)變化相似。綠茶多酚(GTPs)是一種抗氧化劑,是綠茶中所提取的多酚類化合物，含豐富的兒茶素，其中以表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)含量最多，占兒茶素含量的50%～60%，被認(rèn)為是GTPs的主要活性物質(zhì)，具有抗氧化、清除自由基的積極作用〔4，5〕，在許多神經(jīng)變性疾病中顯示出神經(jīng)保護(hù)作用。本研究以神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)注射C57BL/6J老年小鼠建立PD模型，研究預(yù)防性GTPs干預(yù)是否存在對(duì)PD老年模型多巴胺能神經(jīng)元存在更好的保護(hù)和修復(fù)作用并進(jìn)一步探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性C57BL/6J小鼠，SPF級(jí)，18月齡60只，體重20～25 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證編號(hào)：SCXK(京)2009-0004；飼養(yǎng)條件：桂林醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室，許可證號(hào)：SYXK桂2007-0001。飼以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的飼料(成分為大米粉、玉米粉、魚(yú)粉等)。自由攝食、飲水，適應(yīng)環(huán)境1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室溫度25℃～28℃，通風(fēng)、自然采光。

1.2主要試劑 GTPs，由浙江東方茶業(yè)科技有限公司提供， 生產(chǎn)批號(hào)為20070518， GTPs純度100%，其中EGCG 含量為70.75%。MPTP購(gòu)自Sigma公司。兔抗酪氨酸羥化酶抗體(TH)由Bioworld 公司提供，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒和丙二醛(MDA)試劑盒均購(gòu)自南京建成公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3動(dòng)物分組及處理 隨機(jī)分成預(yù)防組、MPTP組、治療組和空白對(duì)照組，各組均為15只。MPTP處理方式為腹腔注射MPTP(30 mg/kg)，1次/d，連續(xù)7 d；GTPs干預(yù)方式為在小鼠飲水中摻入GTPs，濃度為0.1%(W/V)。

模型組：每日上午MPTP處理。預(yù)防組：注射MPTP前3個(gè)月開(kāi)始GTPs干預(yù)MPTP處理。治療組：MPTP處理后開(kāi)始GTPs干預(yù)3個(gè)月?？瞻讓?duì)照組：腹腔注射同體積的生理鹽水，連續(xù)7 d。

1.4黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目測(cè)定 各組動(dòng)物各取7只進(jìn)行免疫組織化學(xué)方法測(cè)定黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目。麻醉動(dòng)物后以4%多聚甲醛經(jīng)心灌注斷頭取腦后固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片(片厚4 μm)，隔三取一，后行TH染色：二甲苯梯度脫蠟，無(wú)水乙醇，95%乙醇，蒸餾水進(jìn)行水化處理，0.01 mol/L PBS洗3次；切片甩干，用免疫組化專用油筆在腦切片周圍畫(huà)圈；3%過(guò)氧化氫室溫孵育30 min；0.01 mol/L PBS洗3次；加封閉液室溫20 min；加TH(1∶200)4℃過(guò)夜； 0.01 mol/L PBS洗3次；加二抗(1∶200)室溫，2 h孵育；0.01 mol/L PBS洗3次；加鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶(1∶100)，室溫1 h。DAB液顯色3～10 min；PBS終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染5 min；梯度酒精脫水，中性樹(shù)脂封片。

1.5SOD和MDA水平測(cè)定 各組動(dòng)物各取8只進(jìn)行SOD和MDA水平測(cè)定。小鼠迅速斷頭取腦,冰上分離中腦腹側(cè)組織，吸干稱重后置于勻漿器內(nèi)充分勻漿，低溫 14 000 r/min離心30 min，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定氧化應(yīng)激標(biāo)志物SOD和脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA水平。

2 結(jié) 果

2.1黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元計(jì)數(shù)結(jié)果 TH陽(yáng)性神經(jīng)元胞體聚集于黑質(zhì)致密區(qū)(SNc)，突起密集分布于黑質(zhì)網(wǎng)質(zhì)區(qū)(SNr)。與空白對(duì)照組TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(235±22.5)比較，預(yù)防組(201±20.5)、治療組(185±21.9)、MPTP組(150±23.2)均明顯降低(P<0.01)，但預(yù)防組降低幅度最小。見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠腦組織黑質(zhì)TH疫組織化學(xué)染色(×100)

2.2SOD和MDA水平測(cè)定 MPTP組、預(yù)防組和治療組SOD水平均較空白對(duì)照組降低(P<0.01)，而MDA水平則相反(P<0.01)，變化幅度預(yù)防組<治療組

表1 各組SOD和MDA測(cè)定結(jié)果

3 討 論

PD是與衰老密切相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，平均發(fā)病年齡為60周歲，故而本實(shí)驗(yàn)選擇老年動(dòng)物建立模型，力求最大限度接近PD真實(shí)的發(fā)病背景。衰老與氧化應(yīng)激反應(yīng)之間的密切關(guān)系已被許多實(shí)驗(yàn)所研究并證實(shí)。衰老是由于自由基進(jìn)攻細(xì)胞，過(guò)度氧化所致。隨著年齡增長(zhǎng)自由基清除劑活性下降，大量有害自由基會(huì)破壞組織細(xì)胞，組織器官的機(jī)能逐步發(fā)生紊亂及障礙，過(guò)多的活性氧自由基就會(huì)有破壞行為，導(dǎo)致人體正常細(xì)胞和組織的損壞，心臟病、老年癡呆癥、PD和腫瘤等疾病就會(huì)接踵而來(lái)。 以MPTP成功誘導(dǎo)C57BL/6J老年小鼠建立經(jīng)典的亞急性PD模型后用GTPs進(jìn)行干預(yù),發(fā)現(xiàn)GTPs能夠有效減少M(fèi)PTP造成的黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的丟失、降低SOD及提高M(jìn)DA水平和活性，增加抗氧化能力，尤其是在損傷前使用GTPs干預(yù)的預(yù)防組各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于GTPs后處理的治療組。

PD特征性病理變化為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的大量變性缺失，當(dāng)達(dá)到60%～80%水平時(shí)就會(huì)出現(xiàn)靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩等典型癥狀。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用GTPs干預(yù)后證實(shí)GTPs能夠減少多巴胺能神經(jīng)元的缺失起到保護(hù)作用，而在損傷前進(jìn)行預(yù)防性用藥則能達(dá)到更佳效果。PD發(fā)病機(jī)制至今不甚明了，但是隨年齡增長(zhǎng)同時(shí)升高的氧化應(yīng)激水平已為大多數(shù)學(xué)者所關(guān)注和認(rèn)同的研究熱點(diǎn)〔6〕?？寡趸穷A(yù)防衰老的重要步驟，因?yàn)樽杂苫蜓趸瘎?huì)將稀薄的組織分解，影響代謝功能，并會(huì)引起不同的健康問(wèn)題。

SOD和MDA等抗氧化指標(biāo)的測(cè)定是研究氧化應(yīng)激水平的常用手段。EGCG是GTPs的重要活性成分，主要以原型存在于血液和靶器官中，且能夠通過(guò)血腦屏障(BBB)進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)〔7〕，成為其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的前提。預(yù)防性使用GTPs，將整體內(nèi)環(huán)境包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的抗氧化能力和清除自由基的功能〔8〕在病變之前先提升到更高水平或減少由衰老所致過(guò)多的氧自由基，降低體內(nèi)自由基水平，同時(shí)促進(jìn)內(nèi)源性抗氧化酶如SOD的生成，從而提高發(fā)生病理改變的閾值，在同等的致病條件下能降低被損傷程度和范圍，最大限度的保護(hù)包括黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)，其效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于病變之后的治療性用藥的神經(jīng)修復(fù)作用。外源性補(bǔ)充GPTs，通過(guò)抗氧化、抗炎等廣泛的生物活性途徑對(duì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行保護(hù)和修復(fù)，作為防治PD及其他神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病可能的安全的潛在性途徑，具有良好的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。

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