洪 凌 狄良嬌 劉姝男 趙 晶 睢大筼 徐華麗 姜英子 洪 鐵

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院麻醉系，吉林 延吉 133002)

人參對神經(jīng)系統(tǒng)〔1,2〕、心血管系統(tǒng)〔3,4〕、血液系統(tǒng)〔5,6〕、消化系統(tǒng)〔7〕、內(nèi)分泌系統(tǒng)〔8〕、免疫系統(tǒng)〔9,10〕及泌尿生殖系統(tǒng)〔11〕都有調(diào)節(jié)作用。目前國際市場上，美國、加拿大、日本、韓國等發(fā)達(dá)國家已把人參作為食品應(yīng)用，中國在20世紀(jì)90年代之前部分人參制品被允許作為食品在市場上銷售，但2002年衛(wèi)生部發(fā)布《關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》，人參被列入《可用于保健食品的物品名單》中，被局限于保健品食用范圍，為了更好的利用人參資源，2012年衛(wèi)生部年根據(jù)《中華人民共和國食品安全法》和《新資源食品管理辦法》，批準(zhǔn)人參(人工種植)為新資源食品。為探討人參(人工種植)食用對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，本文擬探討人參原粉、水提取物及乙醇提取物對正常成年小鼠免疫功能影響的研究。

1 材料與方法

1.1實驗動物 ICR小鼠，清潔級，由吉林大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：(吉)2008-0005。

1.2實驗藥品 實驗用生曬參(5年生)產(chǎn)于吉林撫松縣。人參原粉系200目的細(xì)粉；人參水提物系兩次水煎煮提取，過濾，濃縮，烘干得人參干粉末，提取率為40.09%，其中人參總皂苷含量約為0.99%，人參多糖含量為7.54%；人參醇提物系70%乙醇加熱回流提取人參粗粉，過濾，濃縮，烘干得人參浸膏，提取率為30.8%，其中人參總皂苷含量約為2.33%，人參多糖含量為0.76%。上述三種實驗藥品均由長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心生物工程實驗室提供，批號分別為：20101216、20110407、20110331。

1.3給藥方式及方法 將100只正常成年ICR小鼠隨機(jī)分為10組，即：對照組，5年生種植人參原粉小、中、大劑量(0.35、0.75、1.4 g生藥/kg)組，5年生種植人參水提物小、中、大劑量(0.35、0.75、1.4 g生藥/kg)組，5年生種植人參醇提物小、中、大劑量(0.35、0.75、1.4 g生藥/kg)組，每組10只。各組小鼠均每天灌胃給藥 1次，連續(xù)3 個月。

1.4實驗試劑 胎牛血清，中美合資蘭州民海生物工程有限公司，批號：20081028； RPMI-1640培養(yǎng)液，Gibco公司；青霉素、鏈霉素，華北制藥股份有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)， Fluka公司；二甲基亞砜(DMSO)，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.5實驗儀器 Bio-rad 680型酶標(biāo)儀，美國伯樂Bio-rad公司生產(chǎn)；CO2培養(yǎng)箱為日本三洋(Sanyo)公司生產(chǎn)； TGL-16G-A型低溫離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)。

1.6細(xì)胞株 L929細(xì)胞株由吉林省腫瘤醫(yī)院提供。

1.7方法

1.7.1正常成年小鼠免疫器官測定 取ICR小鼠100只，隨機(jī)分為十組，每組10只，組別與給藥劑量如表1所示，實驗組每日1次連續(xù)灌胃給藥90 d，正常組灌服同體積蒸餾水末次給藥24 h后，稱量體重，摘出胸腺及脾，稱重，計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，公式如下：胸腺指數(shù)=胸腺重(mg)÷體重(g)；脾臟指數(shù)=脾重(mg)÷體重(g)。

1.7.2正常小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定 取ICR小鼠100只，組別與給藥劑量如表2所示，給藥組每日一次連續(xù)灌胃給藥90 d，正常灌服同體積蒸餾水末次給藥24 h后，每鼠腹腔注射5% 雞紅細(xì)胞0.4 ml，8 h后將動物處死，仰位固定于鼠板，消毒腹部，剪開皮膚，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2 ml，轉(zhuǎn)動固定板1 min，然后抽取腹腔液1 ml滴于干凈載玻片上，每片0.2 ml，共2片，放在墊有濕紗布的搪瓷盒中，置于37℃孵箱中溫育30 min，取出玻片，用生理鹽水漂洗，以除去未貼片的細(xì)胞。晾干，以丙酮-甲醇液(1∶1)固定5 min，再用4%姬姆薩-瑞特氏染色液染色3 min，用蒸餾水漂洗，晾干。在顯微鏡下觀察小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬情況，按下列公式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)：吞噬百分率(%)=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)÷200個巨噬細(xì)胞×100%，吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)÷200個巨噬細(xì)胞。

1.7.3正常自然殺傷細(xì)胞活性的測定 取ICR小鼠100只，給藥組每日1次連續(xù)灌胃給藥90 d，正常灌服同體積蒸餾水末次給藥24 h后，每日1次，末次給藥1 h后處死小鼠，浸入75%乙醇中約2 min，置于超凈工作臺中無菌開腹，取脾臟，放入盛有5 ml Hank液的平皿中清洗，除去血液。吸去Hank液，用砂面載玻片研磨，制成脾細(xì)胞混懸液。將制得的脾細(xì)胞混懸液1 500 r/min離心2次，添加紅細(xì)胞裂解液2 ml在37℃恒溫水浴靜置5 min，1 500 r/min離心10 min，棄上清，Hank’s洗滌兩次，用10%的胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液將脾細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)調(diào)整成濃度為1×107/ml的細(xì)胞懸液，此細(xì)胞做為效應(yīng)細(xì)胞，備用。將傳代培養(yǎng)的L929細(xì)胞在試驗前1 d換液，實驗時用0.25%的胰蛋白酶1 ml消化2 min，輕輕吹打細(xì)胞使其完全從壁上脫落，加入完全RPMI-1640培養(yǎng)液，終止消化，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，將沉積細(xì)胞重懸于含10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中，調(diào)細(xì)胞濃度至2×105/ml，即備用的NK細(xì)胞的靶細(xì)胞。將準(zhǔn)備好的靶細(xì)胞懸液加入96孔平底培養(yǎng)板中，0.1 ml/孔，然后放入5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，使靶細(xì)胞貼壁成一單層細(xì)胞，向每孔加入0.1 ml效應(yīng)細(xì)胞(使效靶比例為50∶1)，每樣品設(shè)4個復(fù)孔，靶細(xì)胞對照孔加入完全RPMI1640培養(yǎng)液 0.1 ml，放置于5% CO2的37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h，傾去上清液，用37℃生理鹽水輕輕灌滿各孔，反復(fù)洗滌3次，以除去效應(yīng)細(xì)胞及被殺死而脫落的靶細(xì)胞，在濾紙上吸干孔內(nèi)水分，每孔加0.1 ml 0.1%的中性紅染液，5% CO2的37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，棄去染液，再用生理鹽水洗滌3次后，每孔加入0.1 ml細(xì)胞裂解液(50%醋酸和50%乙醇配制)，使吞噬中性紅的靶細(xì)胞溶解，釋放出中性紅，輕輕搖勻。在酶標(biāo)儀波長570 nm處測定光密度(OD)值，并計算殺傷率，公式：殺傷率(%)=(靶細(xì)胞OD值-實驗組OD值)÷靶細(xì)胞OD值×100%。

1.7.4正常小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的測定 取ICR小鼠100只，組別與給藥劑量如表3所示，給藥組每日一次連續(xù)灌胃給藥90 d，末次給藥1 h后，處死動物。將小鼠于超凈工作臺無菌開腹，取脾臟放入盛有5 ml Hank液的平皿中清洗，去除血液，吸去Hank液，用帶有磨面的載玻片進(jìn)行研磨，并用Hank液輕輕沖洗篩網(wǎng)，制成脾細(xì)胞懸液，2%臺盼藍(lán)試驗證實細(xì)胞存活率>95%。將制得的細(xì)胞懸液1 500 r/min離心，棄上清，添加紅細(xì)胞裂解液2 ml，在37℃水浴上靜置5 min，1 500 r/min離心，棄上清，用Hank液洗2次，用10%的胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)成5×106/ml，接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔180 μl，置于5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，每孔加入刀豆素A(ConA)(終濃度5 μg/ml)或脂多糖(LPS)(終濃度10 μg/ml)各10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入濃度為5 mg/ml的噻唑藍(lán)(MTT)溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，輕輕吸去培養(yǎng)液后，加入二甲基亞砜(DMSO)溶液100 μl，振蕩10 min，于酶標(biāo)儀波長為570 nm處測定光密度(OD)值，計算增殖率，公式如下： 增殖率(%)=實驗組OD值÷對照組OD值×100%。

1.7.5正常小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的測定 取ICR小鼠100只，按表3所示組別及劑量進(jìn)行分組，給藥組每日1次連續(xù)灌胃給藥90 d，末次給藥后1 h處死小鼠，按上述“對正常小鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響”中方法制備淋巴細(xì)胞，將制備好的淋巴細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔190 μl，置于5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，每孔加入ConA(終濃度5 μg/ml)10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，小心取上清，備用，采用ELISA方法測定上清液中的分泌細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-2、干擾素(IFN)-γ的水平。

1.7.6正常小鼠血清IgG產(chǎn)生的測定 取ICR小鼠100只，按表3所示組別及劑量進(jìn)行分組給藥組每日1次連續(xù)灌胃給藥90 d，實驗結(jié)束前7 d，腹腔注射20%綿羊紅細(xì)胞(SRBC)0.2 ml初次免疫，處死動物前再次注射20% SRBC 0.2 ml免疫小鼠。處死動物前禁食12 h，取血，制備血清，采用ELISA法檢測血清中IgG含量。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1對正常成年小鼠胸腺、脾臟重量及脾臟淋巴細(xì)胞增殖率的影響 與對照組比較，人參水提物大劑量組和人參醇提物中、大劑量組均可使正常成年小鼠胸腺、脾臟重量明顯增高(P<0.05)，人參原粉、人參水提物和人參醇提物各劑量組刺激下促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖活性的趨勢。見表1。

2.2人參對各組小鼠吞噬率、吞噬指數(shù)及自然殺傷率的影響 與對照組比較，人參水提物大劑量組和人參醇提物大、中劑量組有增加吞噬率、吞噬指數(shù)及自然殺傷率的趨勢。見表2。

2.3人參對各組小鼠IL-2、 IFN-γ、IgG產(chǎn)生的影響 見表3。

表1 人參對正常成年小鼠胸腺、脾臟重量及脾臟淋巴細(xì)胞增殖率的影響

表2 人參對正常成年小鼠吞噬率、吞噬指數(shù)及自然殺傷率的影響

表3 人參對正常成年小鼠IL-2、 IFN-γ、IgG產(chǎn)生的影響

與對照組比較，人參水提物和人參醇提物大劑量組均可使正常成年小鼠IL-2、 IFN-γ(P<0.05)。人參原粉、人參水提物和人參醇提物各劑量組具有增加IgG含量的趨勢。

3 討 論

本實驗結(jié)果顯示，人參原粉及提取物具有增加正常成年小鼠胸腺、脾臟指數(shù)，增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性，提高自然殺傷細(xì)胞的殺傷率，促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖、提高特異性抗SRBC抗體水平的趨勢；人參水煎煮提取物及人參乙醇提取物大劑量組，顯著增加正常成年小鼠胸腺、脾臟指數(shù)。水煎提取物、乙醇提取物大劑量組顯著增加正常成年小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的細(xì)胞因子IL-2及INF-γ的含量；提示人參原粉及提取物可影響正常成年小鼠的非特異性免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫功能等，能提高機(jī)體免疫力，具有較好的免疫功能增強(qiáng)作用。

本實驗所用人參水提物含有人參總皂苷為0.99%，人參多糖為7.54%，而人參醇提物含人參總皂苷含量為2.33%，人參多糖為0.76%。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人參水提物和醇提物均有提高免疫功能的作用或趨勢，提示人參提高免疫功能的作用可能與人參皂苷或人參多糖有關(guān)。

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