張曦 金歐 黃紅月 侯成成 古潔若

SLE是一種全身多臟器受累的慢性自身免疫性疾病，其主要特征為內(nèi)源性核酸類物質(zhì)對(duì)免疫系統(tǒng)的慢性激活[1］。也就是說，SLE患者循環(huán)免疫復(fù)合物中的DNA/RNA分別被Toll樣受體9/7（TLR-9/7）識(shí)別后，激活相應(yīng)的免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)IFN-α等多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生[1］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，IFN-α的高表達(dá)在SLE的發(fā)病中起關(guān)鍵性作用，IFN-α與自身抗體的產(chǎn)生及疾病活動(dòng)性相關(guān)[2］。雖然具體機(jī)制尚不清楚，但目前大多數(shù)專家認(rèn)為羥氯喹可阻斷TLR識(shí)別核酸類物質(zhì)，從而在SLE的治療中發(fā)揮重要作用。本研究旨在評(píng)估羥氯喹是否能夠有效抑制因TLR-9激活所致的IFN-α的高表達(dá)，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

本研究所使用的健康志愿者的PBMC均是通過蔗糖密度梯度離心法從人外周血白膜中分離所得，分離好的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）洗滌2次后，使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)待用。本研究中所用到的白膜由廣州血液中心免費(fèi)提供。

二、主要試劑及儀器

1.主要試劑

包括：人外周血淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镏苿┕荆琑PMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone，美國），Trizol總RNA 抽提試劑、ODN 2216（Invitrogen，美國），隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄制備模板DNA試劑盒及熒光實(shí)時(shí)定量PCR系列試劑盒（TakaRa，日本），氯仿、異丙醇、無水乙醇（廣州東征公司），焦碳酸二乙酯、羥氯喹（Sigma，美國）。

2.主要儀器

包括：SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），HF151恒溫培養(yǎng)箱（力新儀器有限公司），奧林巴斯IX51顯微鏡（日本），Thermo Nandrop 2000核酸蛋白分析儀（美國），ABI 2700 PCR儀、ABI 7500熒光定量PCR擴(kuò)增儀（美國）。

三、方 法

1.細(xì)胞水平模擬SLE高表達(dá)IFN-α

將TLR-9配體ODN 2216（0、0.375、0.75、1.5、3.0、6.0μg/ml）與健康志愿者來源的PBMC（2×106/ml）在5%CO、37℃的恒溫箱內(nèi)共同培養(yǎng)12 h后，檢測(cè)不同濃度PBMC中IFN-αmRNA表達(dá)水平。另外，使用ODN 2216 1.5μg/ml與健康志愿者來源的PBMC（2×106/ml）在5%CO、37℃的恒溫箱內(nèi)共同培養(yǎng)0、6、12、24、48 h后，檢測(cè)不同時(shí)間PBMC中IFN-αmRNA表達(dá)水平。

2.不同處理組PBMC IFN-αmRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

使用ODN 2216 1.5μg/ml與健康志愿者來源的PBMC（2×106/ml）在5%CO、37℃的恒溫箱內(nèi)共同培養(yǎng)6 h后，按參考文獻(xiàn)[3］分別加入羥氯喹1.25μg/ml（實(shí)驗(yàn)組）及等量的培養(yǎng)基（陽性對(duì)照組），在未加入ODN 2216的PBMC內(nèi)加入等量的培養(yǎng)基（空白對(duì)照組），繼續(xù)培養(yǎng)12 h后檢測(cè)各組PBMC中IFN-αmRNA表達(dá)水平。

3.熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

收集各組細(xì)胞，提取各組細(xì)胞的總RNA，然后使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同處理組PBMC中IFN-αmRNA表達(dá)水平，引物序列見表1，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)按ΔΔCt法計(jì)算分析。

表1 IFN-α及β-actin的引物序列

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以示，多個(gè)處理組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩獨(dú)立樣本間的比較使用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)胞水平模擬SLE高表達(dá)IFN-α的致病狀態(tài)

1.不同濃度TLR-9對(duì)PBMC中IFN-αmRNA表達(dá)水平的影響

使用不同濃度的ODN 2216與健康志愿者來源的PBMC共同培養(yǎng)12 h后，不同濃度組PBMC中IFN-αmRNA表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.728，P＜0.001）。其中ODN 2216濃度為1.5 μg/ml的處理組中IFN-αmRNA表達(dá)水平最高，且明顯高于未予ODN 2216干預(yù)組（P＜0.001），見圖1。

2.不同時(shí)間對(duì)PBMC中IFN-αmRNA表達(dá)水平的影響

使用濃度為1.5μg/ml的ODN 2216分別與健康志愿者來源的PBMC共同培養(yǎng)0～48 h后，不同干預(yù)時(shí)間組PBMC中IFN-αmRNA表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=17.414，P＜0.001）。與1.5μg/ml的ODN 2216共同培養(yǎng)6 h組PBMC中IFN-αmRNA表達(dá)水平明顯高于未予ODN 2216干預(yù)組（P＜0.001），見圖2。

圖1 不同濃度ODN 2216與PBMC共同培養(yǎng)12 h后IFN-αmRNA表達(dá)水平比較

圖2 經(jīng)1.5μg/ml ODN 2216干預(yù)不同時(shí)間后PBMC中IFN-αmRNA表達(dá)水平比較

二、不同處理組PBMC中IFN-αmRNA表達(dá)水平比較

陽性對(duì)照組PBMC中IFN-αmRNA表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組（t'=-5.151，P=0.002）。與陽性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組PBMC中IFN-αmRNA表達(dá)水平明顯降低（t'=3.34，P=0.042），見圖3。

圖3 不同處理組PBMC中IFN-αmRNA表達(dá)水平比較

討 論

漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDC）在SLE發(fā)病中的起重要作用。無論是在外周血還是淋巴結(jié)中，經(jīng)TLR-7/TLR-9激動(dòng)劑激活的pDC均被認(rèn)為是IFN-α的主要來源[4-5］。然而，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)SLE患者外周循環(huán)中pDC數(shù)量減少和（或）功能存在障礙[6］。此外，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其他類型的細(xì)胞（如單核細(xì)胞、髓樣樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞）也可以產(chǎn)生IFNα[5］。因此，除了pDCs外，其他類型的細(xì)胞也可能是SLE患者中IFN-α的重要來源。本研究選用包含多種類型細(xì)胞的PBMC作為研究對(duì)象，使用TLR-9激動(dòng)劑 （ODN 2216）與PBMC共同培養(yǎng)，在體外成功模擬了SLE患者中IFN-α高表達(dá)的致病模型。

抗瘧藥自1894年起就已用于治療SLE的皮膚型狼瘡[7-8］。一項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，使用羥氯喹（抗瘧藥）治療的SLE患者較使用安慰劑患者，疾病復(fù)發(fā)率及嚴(yán)重程度明顯降低[5］。早在1998年，羥氯喹已被發(fā)現(xiàn)能抑制CpGDNA所誘導(dǎo)的細(xì)胞活化[5］?；诹u氯喹的弱堿性特質(zhì)，大量的研究均認(rèn)為羥氯喹是通過抑制內(nèi)體酸化，從而抑制內(nèi)體中TLR識(shí)別核酸類物質(zhì)[5］。但是，新近研究證實(shí)羥氯喹等抗瘧藥可直接結(jié)合TLR上的核酸結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制TLR[9］。本研究發(fā)現(xiàn)羥氯喹可明顯著抑制ODN 2216刺激后PBMC中IFN-α的高表達(dá)，結(jié)合前人的研究，推測(cè)羥氯喹可通過抑制TLR-9識(shí)別核酸類物質(zhì)，從而抑制IFN-α的高表達(dá)。

綜上所述，羥氯喹可明顯抑制PBMC中TLR-9介導(dǎo)的IFN-α高表達(dá)，考慮到IFN-α在SLE的發(fā)病中起關(guān)鍵作用，推測(cè)羥氯喹可通過抑制TLR-9介導(dǎo)的IFN-α的高表達(dá)，從而有效的控制SLE的病情進(jìn)展。

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