余作沖 熊敏 吳靖平 張新潮 尹望平 范衛(wèi) 史繼明

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院骨科，上海 201508)

椎間盤退變(intervertebral disc degeneration,IVDD)是脊柱退行性疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ)[1]。目前，椎間盤退變的具體機(jī)制尚不明確。治療椎間盤退變的藥物或手段較多[2]，目前對轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)的研究是熱點(diǎn)。TGF-β是一種多肽類細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)形成和抑制免疫反應(yīng)等作用。TGF-β3能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和軟骨的前體細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，并促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成軟骨基質(zhì)。因此，TGF-β3具有較強(qiáng)的促進(jìn)軟骨修復(fù)的功能。本研究通過在椎間盤退變大鼠的軟骨終板中注射TGF-β3，觀察軟骨終板細(xì)胞的凋亡情況，從而探討TGF-β3在椎間盤退變中的作用。

1 資料與方法

1.1 椎間盤退變大鼠模型的建立 87只新生的SD大鼠為上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供的15只預(yù)產(chǎn)期為同日的孕鼠的子代，于出生后24～48 h內(nèi)截去雙前肢，3周齡后移走母鼠停止哺乳。此后，根據(jù)大鼠的不同生長階段采用相應(yīng)的飼養(yǎng)條件，并使其養(yǎng)成只有依靠雙后肢站立才能進(jìn)食和飲水的生活習(xí)慣，以此訓(xùn)練大鼠的直立活動，使其發(fā)生椎間盤退變[3]。見圖1。

圖1 雙后肢站立大鼠模型

1.2 模型建立成功與否驗(yàn)證 SD大鼠飼養(yǎng)18個月后，隨機(jī)選取5只，腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉后處死，立即取腰段脊柱，剔除周圍附著的肌肉等組織，將標(biāo)本置入中性甲醛固定，然后置于10%乙二胺四乙酸-磷酸緩沖液脫鈣，室溫放置3周，切片，并用蘇木素-伊紅(HE)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腰段椎間盤髓核細(xì)胞及纖維環(huán)細(xì)胞形態(tài)，如髓核和纖維環(huán)退變，即可判斷椎間盤退變大鼠模型建立成功(見圖2)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及TGF-β3注射 造模成功后，選取存活的SD大鼠中的60只，隨機(jī)分成對照組、0.9%氯化鈉組及TGF-β3組，每組20只。腹腔注射麻醉藥物，消毒鋪巾，背側(cè)正中旁1.0 cm切開，上提大鼠棘突，肌間隙內(nèi)分離暴露腰3、4節(jié)段椎體側(cè)前方；用20 μ L的微量注射器在0.9%氯化鈉液組和TGF-β3組大鼠軟骨終板內(nèi)及周邊分別注射TGF-β3(100 ng/mL)和0.9%氯化鈉液各160 μ L(上下終板各80 μ L，前、后、左、右各20 μ L)，注射后于腰3、4椎體間縫線標(biāo)記；每周注射1次，連續(xù)3次。

1.4 蠟塊及切片制備 戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射后處死60只模型鼠，立即整段截取腰3、4椎體及椎間盤(縫線標(biāo)記處)，剔除周圍附著的肌肉等組織；將標(biāo)本置入中性甲醛中固定24 h，制備蠟塊并切片。

1.5 Tunel染色 將切片脫蠟至水，用20 μg/mL蛋白酶K透明處理，室溫孵育25 min，3%H2O2甲醇溶液封閉，滴加Tunel染色反應(yīng)液(設(shè)陰性對照組，用PBS替代反應(yīng)液)，漂洗后加底物3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色10 min，蘇木素復(fù)染，脫水透明、封片(試劑盒由德國MERCK公司提供)。

1.6 細(xì)胞計(jì)數(shù) 200倍光鏡下，每張切片中選取陽性細(xì)胞較多的數(shù)個視野，數(shù)500個細(xì)胞，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞個數(shù)，以百分?jǐn)?shù)表示細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。

2 結(jié) 果

對各組軟骨終板組織行Tunel染色(見圖3)后，計(jì)算各組AI。對照組、0.9%氯化鈉液組及TGF-β3組的終板軟骨細(xì)胞AI分別為(26.60±4.98)%、(60.65±5.28)%、(44.25±5.85)%。0.9%氯化鈉液組的AI高于對照組(P<0.05)；TGF-β3組AI低于0.9%氯化鈉液組(P<0.05)，但高于對照組(P<0.05)。見圖4。

100倍光鏡示髓核外形皺縮，體積變小，部分出現(xiàn)裂隙, 局部有片狀變性壞死區(qū)域(見箭頭①)，髓核組織中出現(xiàn)大量軟骨樣細(xì)胞(見箭頭②)

A.對照組凋亡的軟骨終板細(xì)胞核呈棕褐色改變，散在分布；B.TGF-β3組棕褐色的細(xì)胞數(shù)較對照組多；C.0.9%氯化鈉液組棕褐色的細(xì)胞數(shù)較TGF-β3組多；D.對照組。

圖4 軟骨終板細(xì)胞的凋亡指數(shù)(AI)

3 討 論

3.1 軟骨終板退變對椎間盤退變的影響 椎間盤是由終板、髓核及纖維環(huán)三部分組成，纖維環(huán)包繞膠凍樣髓核，二者上下方為軟骨終板。軟骨終板是是承擔(dān)身體重力負(fù)荷的重要結(jié)構(gòu)及髓核的主要營養(yǎng)來源，其硬化、鈣化或增厚均可影響椎間盤的結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，從而引發(fā)椎間盤退變[4]。軟骨終板細(xì)胞是軟骨細(xì)胞的一種,其表型與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞類似,均可表達(dá)Ⅱ型膠原及蛋白多糖[5]。

3.2 針刺創(chuàng)傷對軟骨終板退變的影響 有研究[6]用針刺方法建立鼠椎間盤退變模型，發(fā)現(xiàn)大號針頭可導(dǎo)致椎間盤高度丟失，髓核黏多糖減少，髓核膠原增加 。本研究中0.9%氯化鈉液組和TGF-β3組軟骨終板細(xì)胞AI較對照組高，這可能與針刺創(chuàng)傷可促進(jìn)軟骨終板的退變有關(guān)。

3.3 細(xì)胞調(diào)亡在椎間盤軟骨終板退變中的作用 細(xì)胞凋亡可能參與椎間盤組織退變的病理生理過程，是退變椎間盤組織中細(xì)胞數(shù)量減少的主要原因[7]。其機(jī)制之一是：軟骨終板細(xì)胞凋亡使椎間盤內(nèi)Ⅱ型膠原蛋白生成減少，導(dǎo)致椎間盤退變[8]。本研究對造模成功大鼠的軟骨終板組織行Tunel染色，鏡下可見對照組有散在的終板凋亡細(xì)胞，證實(shí)了上述結(jié)論。

3.4 TGF-β3對椎間盤軟骨終板細(xì)胞凋亡的抑制作用 研究[9]表明，TGF-β3具有很強(qiáng)的促進(jìn)軟骨生長及分化的作用。Bouffi等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β3能夠誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向軟骨細(xì)胞分化。TGF-β3還可以通過調(diào)節(jié)TGF-β1/β2比例，抑制成纖維細(xì)胞的增殖，抑制組織纖維化的發(fā)生[11]。有研究[12]認(rèn)為，TGF-β3能有效地促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌軟骨基質(zhì)等。

3.5 本研究的不足 TGF-β3在體內(nèi)降解較快，如何延長TGF-β3體內(nèi)作用時間是我們今后工作的重點(diǎn)。針刺創(chuàng)傷因素可能會加重椎間盤退變，在臨床治療中是否可以通過靶向給藥避免此類創(chuàng)傷？需要我們進(jìn)一步探索。

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