馮 銳，鄭 穎，張俊貞，王明霞，劉 江，尉曉然(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050011)

·論著·

高效液相色譜法測(cè)定血漿中瑞芬太尼含量

馮 銳，鄭 穎，張俊貞，王明霞*，劉 江，尉曉然
(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050011)

目的建立血漿中瑞芬太尼高效液相色譜測(cè)定方法，為臨床合理用藥提供依據(jù)。方法血漿樣品用1-氯丁烷進(jìn)行萃取，上清液提取至0.01mol/L鹽酸溶液中。分析柱為spherisorb-CN，流動(dòng)相為0.02mol/L的NaH2PO4水溶液-乙腈(70∶30)，內(nèi)含三乙胺0.01%，流速1.5mL/min，柱溫為室溫，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，進(jìn)樣量為200μL。選擇擇期行胸科手術(shù)患者8例，靶控輸注瑞芬太尼濃度(Cp)6μg/L復(fù)合異丙酚2.5mg/kg，分別在瑞芬太尼靶控輸注前及靶控輸注后5、10、20、30、60、90min時(shí)抽取橈動(dòng)脈血，用高效液相色譜法測(cè)定瑞芬太尼血藥濃度(Cm)。結(jié)果人血漿中瑞芬太尼檢測(cè)濃度在2.5～300μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 1)。日內(nèi)日間精密度均在10%以內(nèi)，提取回收率大于78.57%，方法回收率在96.03%～104.67%。在靶控輸注5～20min時(shí)，瑞芬太尼測(cè)定濃度低于靶控輸注濃度(P<0.05)，30～90min兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論該方法操作簡(jiǎn)便，分離度好，其專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍及穩(wěn)定性均適合實(shí)際樣品的檢測(cè)。

瑞芬太尼；血漿；色變法，高壓液相

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.09.016

瑞芬太尼(remifentanil)是一種新型的μ阿片受體激動(dòng)劑，該藥結(jié)構(gòu)中含一個(gè)酯鍵，易被血液及其他組織中的非特異性酯酶快速降解，且有很強(qiáng)的脂溶性，廣泛分布于組織中，具有起效迅速、鎮(zhèn)痛效能強(qiáng)、作用持續(xù)時(shí)間短和可控性好等特點(diǎn)，是理想的靜脈麻醉靶控輸注藥物[1]。有關(guān)瑞芬太尼血藥濃度的測(cè)定方法,受靈敏度要求高的限制，目前報(bào)道多為液質(zhì)聯(lián)用[2]、氣質(zhì)聯(lián)用[3]等，這些方法對(duì)檢測(cè)儀器要求較高，成本較大，使其在臨床上的應(yīng)用受到限制。本試驗(yàn)建立高效液相色譜法測(cè)定瑞芬太尼血藥濃度，旨在為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器：高效液相色譜儀，包括515泵、2487紫外檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；800型離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠)；XW80A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；梅特勒AE240電子分析天平(瑞士)。麻醉機(jī)Datex-OhmedaCapnomacUltimaTM芬蘭；呼吸機(jī)Datex-Ohmeda7900SmartVent芬蘭。

1.2 試藥：鹽酸瑞芬太尼對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)171260-200601)；空白血漿(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院血液中心)；乙腈、甲醇為色譜純；三乙胺、1-氯丁烷等其他試劑為分析純；水為重蒸餾水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取鹽酸瑞芬太尼1mg，置于50mL量瓶中，用0.001mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，制成20mg/L的儲(chǔ)備液，再依次稀釋成1 000、100μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分裝后置-50℃冰箱保存。

1.4 緩沖溶液的配制：稱取磷酸二氫鉀2.72g放入燒杯中，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液158mL后加蒸餾水至200mL,調(diào)pH到7.4，配制成0.1mol/LKH2PO4緩沖溶液；稱取磷酸二氫鈉3.12g用1 000mL蒸餾水溶解，用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)至pH6.5，配制成0.02mol/LNaH2PO4緩沖溶液。

1.5 色譜條件：色譜柱Watersspherisorb-CN(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相，乙腈-0.02mol/LNaH2PO4緩沖液(pH6.5)(30∶70)，內(nèi)含0.01%三乙胺,混勻后過(guò)濾超聲備用；流速1.5mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；進(jìn)樣量200μL；室溫下操作。

1.6 血漿樣品處理：取含瑞芬太尼的血漿樣品1.0mL置10mL具塞離心管中，迅速加入20μL10g/L枸櫞酸和1mL0.1mol/LKH2PO4緩沖液(pH7.4)，混勻后精密加入5mL1-氯丁烷，上下振搖10次，渦旋5min，靜置，離心(3 000r/min)10min。取上清液于含有0.01mol/L鹽酸溶液300μL的離心管中，上下振搖10次，渦旋2min，離心(3 000r/min)3min，放入-50℃冰箱，待水相冰凍后，棄除有機(jī)相，取水相200μL進(jìn)樣于高效液相色譜法(highperformanceliquidchromarography，HPLC)分析。

1.7 研究對(duì)象：選擇美國(guó)麻醉醫(yī)師協(xié)會(huì)(ASA)評(píng)級(jí)為Ⅰ～Ⅱ級(jí)的胸外科全身麻醉手術(shù)患者8例，年齡40～60歲，體質(zhì)量指數(shù)不超過(guò)30。排除有藥物過(guò)敏史者，經(jīng)身體檢查心、肺、肝、腎功能不正常者，膽堿酯酶異常病史及家族史者，長(zhǎng)期服用阿片類藥物史者。剔除麻醉過(guò)程不平穩(wěn)，有明顯術(shù)中出血者。所有受試者試驗(yàn)前均簽署患者知情同意書(shū)，試驗(yàn)方案經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

1.8 麻醉方法：所有患者均于麻醉前30min肌內(nèi)注射咪達(dá)唑侖0.05mg/kg和阿托品0.5mg。患者入手術(shù)室后開(kāi)放一側(cè)上肢靜脈通路，輸注復(fù)方乳酸鈉注射液8mL/kg，麻醉誘導(dǎo)用靶控輸注瑞芬太尼6μg/L復(fù)合異丙酚2.5mg/kg，待患者意識(shí)消失后靜脈注射羅庫(kù)溴銨，行氣管插管，插管成功后，連接Ohmeda7900型呼吸機(jī)行間歇正壓通氣，呼吸頻率為14～16次/min，潮氣量8～10mL/kg，呼吸比為1∶1.5，調(diào)節(jié)氧流量為1L/min，呼吸末二氧化碳分壓控制在30～35mmHg。持續(xù)吸入七氟醚，間斷注射維庫(kù)溴銨維0.03mg/kg維持肌肉松弛。術(shù)畢給予新斯的明2mg和阿托品1mg拮抗殘留肌肉松弛作用，患者自主呼吸完全恢復(fù)(呼吸頻率>10次/min，PETCO2<50mmHg)，清醒后拔管。

1.9 取血方法：分別在麻醉前及瑞芬太尼靶控輸注5、10、20、30、60、90min抽取橈動(dòng)脈血3mL，置入肝素試管中，并迅速加入10g/L枸櫞酸20μL，充分搖勻后離心取上清液，放入-50℃冰箱保存。

2 結(jié) 果

2.1 方法專屬性考察：通過(guò)對(duì)瑞芬太尼對(duì)照品，空白血漿，含瑞芬太尼對(duì)照品血漿，患者用藥后血樣進(jìn)行HPLC檢測(cè)，結(jié)果表明，采用HPLC法測(cè)定人體血漿中瑞芬太尼的方法專屬性良好。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取一定量瑞芬太尼標(biāo)準(zhǔn)溶液,用空白血漿依次稀釋成2.5、5、10、25、50、100、200和300μg/L的血漿樣品后，按“1.6”項(xiàng)下操作，制備工作曲線。以瑞芬太尼濃度為橫坐標(biāo)，瑞芬太尼峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=503.14X-418.8，(r=0.999 1)。結(jié)果表明，血藥濃度在2.5～300μg/L范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系。最低定量限為2.5μg/L。

2.3 精密度試驗(yàn)：制備瑞芬太尼低、中、高濃度(分別為5、50、200μg/L)的血漿樣品各6份，按“1.6”項(xiàng)下操作，連續(xù)測(cè)定3d，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。高、中、低濃度的日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(relativestandarddeviation,RSD)和日內(nèi)RSD分別小于9.73%和8.01%。見(jiàn)表1。

Nominalconcentration(μg/L)Intra?dayMeasuredconcentration(μg/L)RSD(%)Inter?dayMeasuredconcentration(μg/L)RSD(%)54．87±0．398．014．83±0．479．735050．28±3．036．0348．25±2．755．70200212．82±7．913．72209．23±11．145．32

RSD：relative standard deviation

2.4 提取回收率試驗(yàn)：配制5、50、200μg/L的低、中、高濃度的瑞芬太尼血漿樣品各5份，按“1.6”項(xiàng)下操作，記錄瑞芬太尼峰面積，與相應(yīng)濃度的瑞芬太尼工作液所測(cè)峰面積進(jìn)行比較，比值即為提取回收率。見(jiàn)表2。

2.5 方法回收率試驗(yàn)：配制5、50、200μg/L的低、中、高濃度的瑞芬太尼血漿樣品各5份，按“1.6”項(xiàng)下操作，將瑞芬太尼峰面積代入回歸方程，求出瑞芬太尼濃度，按測(cè)定量除以加入量即為測(cè)定方法回收率。見(jiàn)表2。

Nominalconcentration(μg/L)ExtractionrecoveryRSD(%)MethodrecoveryRSD(%)578．57±3．764．7996．03±5．375．595083．72±2．312．7698．10±4．894．9820088．99±2．202．47104．67±4．584．38

RSD:relative standard deviation

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：制備中等濃度瑞芬太尼(50μg/L)的血漿樣品溶液，考察室溫放置穩(wěn)定性、凍存穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性，RSD分別為5.52%、5.87%、6.58%。結(jié)果顯示，分析過(guò)程中樣品穩(wěn)定。

2.7 患者血樣測(cè)定：患者在靶控輸注5～20min時(shí),測(cè)定瑞芬太尼濃度(Cm)均低于靶控輸注濃度(Cp)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而TCI 30～90min時(shí)Cm與Cp差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。靶控輸液瑞芬太尼在5、10、20、30、90min的中位數(shù)濃度分別為4.0、4.5、4.7、5.1、5.3、5.3μg/L，瑞芬太尼總體血樣Cm為5.1μg/L，低于Cp(P<0.05)。

3 討 論

瑞芬太尼呈粉末狀，易潮解,稱量應(yīng)迅速，其在酸性狀態(tài)下穩(wěn)定，因此用0.001mol/L鹽酸溶解；溫度是影響瑞芬太尼水解的主要因素[4]。本試驗(yàn)將血漿樣品放在冰壺中，保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性；枸櫞酸的濃度需嚴(yán)格掌握，濃度較低(2～5g/L)不足以保證藥物在血漿中的穩(wěn)定性，濃度較高(20g/L)，影響1-氯丁烷的萃取率，本試驗(yàn)枸櫞酸濃度為10g/L既可降低pH值抑制水解酶的活性，又不影響1-氯丁烷萃取率[5]；由于瑞芬太尼是堿性藥物，加入KH2PO4緩沖液調(diào)pH值，可使樣品成分子狀態(tài)提高萃取效率。流動(dòng)相中加入適量的三乙胺不僅有利于改善峰形，而且還可改變?nèi)鸱姨岬谋Ａ魰r(shí)間，使其與干擾峰分開(kāi)。本試驗(yàn)比較了不同流動(dòng)相配比、磷酸鹽緩沖液pH值(3.5和6.5)及三乙胺加入量(300μL/L和0.01%)，經(jīng)研究本試驗(yàn)流動(dòng)相具有峰形好、干擾小、準(zhǔn)確定量的優(yōu)點(diǎn)。

有文獻(xiàn)[6]報(bào)道采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定瑞芬太尼濃度，主要內(nèi)標(biāo)物有GI97559(瑞芬太尼乙基類似物)、芬太尼、氯雷他定[7]、卡馬西平[8]等。內(nèi)標(biāo)GI97559在國(guó)內(nèi)較難找到；試驗(yàn)研究用氯雷他定為內(nèi)標(biāo)，采用氮?dú)獯蹈煞?，發(fā)現(xiàn)樣品易分解且雜質(zhì)峰較多。本試驗(yàn)利用現(xiàn)有條件，對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行綜合比較并改進(jìn)，建立無(wú)內(nèi)標(biāo)的高效液相色譜法。

有文獻(xiàn)[9]報(bào)道提取溶劑可選1-氯丁烷、二氯甲烷、甲基叔丁醚等。二氯甲烷比重較大，萃取時(shí)有機(jī)相取出較難，且雜質(zhì)較多；雖然甲基叔丁醚毒性較小，但本試驗(yàn)經(jīng)比較使用1-氯丁烷提取效率較高，滿足試驗(yàn)要求。萃取時(shí)間短，萃取率低,不利于檢測(cè)；如果延長(zhǎng)萃取時(shí)間和增加萃取次數(shù),則處理總時(shí)間太長(zhǎng)，影響瑞芬太尼穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)比較,采用5mL 1-氯丁烷漩渦5min,單次萃取即可取得滿意的結(jié)果。萃取時(shí)不能過(guò)度振搖，否則易發(fā)生乳化現(xiàn)象。1-氯丁烷萃取時(shí)，溶劑可能使具塞離心管的膠塞變形，造成液體溢出，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)在具塞離心管膠塞蓋上添加雙層鋁箔，既不產(chǎn)生干擾，又保證液體不會(huì)溢出，在國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)中尚未提及。

趙高峰等[5]處理血樣時(shí)，先加甲醇沉淀蛋白防止萃取渦旋時(shí)標(biāo)本的乳化，降低瑞芬太尼的酯酶水解。本試驗(yàn)對(duì)加入甲醇前后進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)對(duì)結(jié)果影響不大，可簡(jiǎn)化此步驟，減少藥物測(cè)定的干擾。

由于靶控輸注系統(tǒng)采用的群體藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與個(gè)體之間存在一定的差異，因此靶控輸注系統(tǒng)并不能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)個(gè)體的實(shí)際血藥濃度水平。本試驗(yàn)結(jié)果表明隨著輸注時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)際測(cè)定濃度與靶控輸注濃度逐漸接近，提示臨床麻醉醫(yī)師應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整麻醉劑量，保證患者麻醉期間的穩(wěn)定性。

本試驗(yàn)建立以高效液相色譜法測(cè)定瑞芬太尼的含量，方法簡(jiǎn)單、快速、有效，為臨床上對(duì)瑞芬太尼血藥濃度的監(jiān)測(cè)提供了較好的分析方法。

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(本文編輯：趙麗潔)

DETERMINATIONOFREMIFENTANILCONCENTRATIONINPLASMABYHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMAROGRAPHY

FENGRui,ZHENGYing,ZHANGJunzhen,WANGMingxia*，LIUJiang，YUXiaoran
(DepartmentofPharmacy,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

ObjectiveHighperformanceliquidchromarography(HPLC)methodwasestablishedfordeterminationofremifentanilinplasma.Thestudywillprovideacademicfoundationforthedevelopmentandclinicaluseofremifentanil.MethodsThesamplesextractedwith1-chlorobutaneandsupernatantwasbackextractedinto0.01mol/LHClagain.Theseparationwasperformedonaspherisorb-CNcolumnwithamobilephaseof0.02mol/L-1NaH2PO4-acetonitrile(70∶30)including0.01%triethylamineataflowrateof1.5mL/min.Thecolumntemperaturewasroomtemperature,thedetection-wavelengthwas210nmand200μLofsolutionwasinjectedintoHPLC.Eightpatientsundergoingthoracicsurgerywereassignedtoreceiveremifentaniltargetcontrolledinfusion(TCI) (6μg/L)andpropofolintravenousinjection(2.5mg/kg).ArterialbloodsamplesweretakenbeforeandafterTCIremifentanil5,10,20,30,60,90minformeasuringofbloodconcentrationofremifentanilbyHPLC.ResultsAlinearitywasobtainedfrom2.5μg/Lto300μg/Lofremifentanilinplasmawithagoodcorrelation(r=0.999 1).Thebetween-dayandwithin-dayRSD%werelessthan10%.Theextractionrecoveriesweremorethan78.57%,andthemethodrecoverieswerebetween96.03%and104.67%.ThedeterminationoftheconcentrationwaslowerthantargetplasmaconcentrationatTCI5minto20min(P<0.05)andtherewasnosignificantdifferencefrom30minto90min(P>0.05).ConclusionThisHPLCmethodissimple,sensitiveandaccurate,anditissuitableforroutinedeterminationofremifentanillevelsinhumanplasma.

remifentanil;plasma；chromatography,highpressureliquid

2013-09-24；

2013-11-05

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(ZL20140342)

馮銳(1981-)，男，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院主管藥師，理學(xué)碩士，從事藥動(dòng)學(xué)和藥物相互作用研究。

*通訊作者

R927.2

A

1007-3205(2014)09-1040-04