曹正輝，王占彬，顧憲紅

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，100193；2.河南科技大學 動物科技學院，河南 洛陽 471003)

轉(zhuǎn)Bt基因糙米對斷奶仔豬潛在致敏性的安全評價

曹正輝1,2，王占彬2，顧憲紅1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院 北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，100193；2.河南科技大學 動物科技學院，河南 洛陽 471003)

試驗旨在研究轉(zhuǎn)Bt(bacillus thuringiensis)基因糙米對斷奶仔豬的致敏性。選用30頭21日齡的“大×白”斷奶仔豬，隨機分為2組，對照組日糧中添加70%的親本非轉(zhuǎn)基因糙米，試驗組日糧中添加70%的轉(zhuǎn)Bt基因糙米，試驗期30 d。在試驗第7 d和28 d采血，試驗第25 d利用Bt基因在水稻中表達的Cry1Ac殺蟲蛋白的標準品進行仔豬的皮膚試敏試驗。結(jié)果表明，對兩組糙米的氨基酸水平進行了檢測和對比分析，發(fā)現(xiàn)兩組糙米的氨基酸水平差異不顯著(P>0.05)；通過對仔豬血清免疫球蛋白E、組織胺含量；血漿中二胺氧化酶活性及D-乳酸含量；唾液皮質(zhì)醇含量等的檢測，結(jié)果顯示兩組間這五個指標均差異不顯著(P>0.05)；利用Cry1Ac的蛋白標準品對仔豬進行的皮膚試敏試驗，結(jié)果顯示兩組均無紅斑產(chǎn)生。由試驗結(jié)果可見，在本試驗條件下，轉(zhuǎn)Bt基因的糙米對仔豬無明顯的致敏性。

Bt基因；糙米;Cry1AC；致敏性

轉(zhuǎn)基因作物在全球的種植量逐年攀升，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的市場份額也逐漸提高，由此引發(fā)的轉(zhuǎn)基因食品的食用安全問題也越來越廣泛的受到關(guān)注[1]。目前對于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全評價的主要側(cè)重于兩個方面：一方面是轉(zhuǎn)基因作物對周圍環(huán)境的安全性，另一方面是食品的食用安全性。其中，轉(zhuǎn)基因食品的食用安全是轉(zhuǎn)基因作物安全評價問題的焦點。Nordlee等[2]的研究報道，轉(zhuǎn)入巴西堅果后的大豆可誘發(fā)對巴西堅果過敏的人發(fā)生過敏反應；2012年Tang等以中國兒童為試驗對象進行的“黃金大米”營養(yǎng)學評價事件等[3-4],引起了人們的足夠重視。因此，評價轉(zhuǎn)基因作物的潛在致敏性安全評價成為了轉(zhuǎn)基因作物安全評價的重要內(nèi)容之一。

大米作為世界上三分之一人口的主糧，每年因為病蟲害損失數(shù)億美元[5]。由于病蟲害問題，人們加大了化工農(nóng)業(yè)的使用，這樣不僅增加了生產(chǎn)的投入成本同時也造成了農(nóng)藥殘留問題造成了生態(tài)系統(tǒng)的紊亂。轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻就是通過基因工程技術(shù)將蘇云金芽孢桿菌(bacillus thuringiensis,Bt)內(nèi)毒素晶體蛋白基因-Cry1Ac基因?qū)氲剿净蚪M中獲得具有抗鱗翅目昆蟲特性的轉(zhuǎn)基因生物新品種。目前，關(guān)于轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻潛在致敏方面的研究鮮少報道，尤其是以仔豬為動物模型的試驗。由于仔豬的消化生理和免疫反應等方面與人類有極大相似性，因此，選擇斷奶仔豬為研究對象，對轉(zhuǎn)Bt基因糙米是否具有潛在致敏性進行安全評價，從而指導轉(zhuǎn)基因水稻在食品生產(chǎn)上的應用提供可靠的依據(jù)。因此，對完善轉(zhuǎn)Bt基因稻米的安全性評價體系具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗中轉(zhuǎn)Bt基因的水稻(浙優(yōu)5號)是由浙大208S×非轉(zhuǎn)基因ZR9兩系雜交所得的抗蟲新品種；對照品種是揚兩優(yōu)6號，為浙優(yōu)5號的親本非轉(zhuǎn)基因品種。兩個品種水稻均由華中農(nóng)業(yè)大學提供；豆粕和豆油由黑龍江九三糧油工業(yè)集團有限公司提供的“九三牌”非轉(zhuǎn)基因大豆粕和大豆油。皮膚試敏試驗時使用的Cry1AC蛋白標準品購于北京科美信達科技有限公司。

1.2 糙米成分的測定

日糧中兩種糙米的氨基酸、粗蛋白、粗纖維、粗脂肪等含量由動物營養(yǎng)學國家重點實驗室按照國標方法分別測定。糙米中Cry1AC殺蟲晶體蛋白含量由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所檢測。

1.3 動物飼養(yǎng)

30頭21日齡斷奶仔豬由中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平試驗豬場提供，使用MLP測定站飼喂，整個飼養(yǎng)過程中豬只自由采食和飲水。試驗期豬舍溫度為19～22 ℃，濕度為61%～72%。

1.4 日糧組成

試驗日糧參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準：NY/T 65-2004《豬飼養(yǎng)標準》[6]豬的營養(yǎng)需要，根據(jù)測定的糙米中各種營養(yǎng)成分含量配制糙米豆粕型日糧，日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。日糧中的其他原料均為非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，日糧以粉料形式飼喂。

表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))Table 1 Ingredients and nutrient levels of the experimental diets(air dry basis)

注：①預混料可為每千克日糧提供：葉酸 0.03 g；維生素B127.4 μg；維生素E 10.6 IU；泛酸 7.5 mg；維生素A 1 370 IU；維生素D3155 IU；維生素K30.5 mg；核黃素 2.29 mg；膽堿 0.3 g；鐵 55.6 mg;銅 3.8 mg；鋅 56.0;錳 2.15 mg；硒 0.18 mg；碘 0.14 mg。②粗蛋白、粗脂肪為實測值、其他為計算值。

Note:①Premix provided the fllowing per kg of diets: folic acid,0.03g;V B127.4μg;V E 10.6 IU;pantothenic acid 7.5 mg;V A 1 370 IU;V D3155 IU;V K30.5 mg;riboflavin 2.29 mg;choline 0.3 g;iron 55.6 mg;copper 3.8 mg;zinc 56.0;manganese 2.15mg;selenium 0.18 mg;iodine 0.14mg.②Crude protein,crude fat were analyzed values,others were calculated.

1.5 試驗設(shè)計

將30頭大白仔豬隨機分為兩個處理：試驗組飼喂轉(zhuǎn)Bt基因的糙米日糧，對照組飼喂非轉(zhuǎn)基因的糙米日糧，每組15頭，每個重復1頭豬，試驗期30 d。兩組于試驗第7 d、28 d 9∶00點，采用自制的唾液采集器無抓捕采集唾液，每圈采集6頭試豬，用于測定皮質(zhì)醇濃度；10∶00點進行前腔靜脈采血，每頭采血2管，一管進行離心收集血清，用于血清免疫球蛋白IgE以及血清組織胺含量的檢測。另外一管進行抗凝處理，用于檢測D-乳酸和二胺氧化酶(DAO)含量。第25 d進行皮膚試敏試驗。

1.6 樣品的采集和制備

1.6.1 唾液皮質(zhì)醇的檢測 試驗第7 d和28 d的上午9∶00 ，采用唾液采集器(鐵絲纏上紗布條)無抓捕采集仔豬的唾液，將紗布懸掛于豬圈上方，供仔豬自由咀嚼，當紗布完全浸濕后用剪刀剪下紗布，置于注射器中擠出唾液樣品，置于離心管中，離心處理。凍離心機0 ℃離心15～20 min(4 000 r/min),取上清液，-80 ℃保存，用于唾液皮質(zhì)醇的檢測，由北京萊博泰瑞科技公司采用放射免疫法分析。

1.6.2 血清免疫球蛋白IgG、IgA以及血清組織胺含量的檢測 試驗的7 d和28 d的上午10∶00，用注射器從前腔靜脈采血5 mL，肝素抗凝處理，用于D-乳酸和DAO含量的檢測。另采血5 mL，不抗凝，室溫傾斜放置30 min，3 000 rpm離心10 min，取血清用以血清免疫球蛋白IgG、IgA以及血清組織胺含量的檢測。

1.6.3 皮膚試敏 試驗的第25 d進行皮膚致敏反應試驗。在試驗的前一天用動物專用剃毛剪小心備皮，暴露出腹部白色皮膚，用油性記號筆畫出皮試的范圍并分區(qū)和標記。試驗開始后，各組仔豬分別腹部標記區(qū)域皮下注射含有Cry1Ac純品蛋白的生理鹽水溶液，注射劑量為0.5 mg/頭，對照組的仔豬在標記區(qū)域注射等量的生理鹽水。在注射30 min后，觀察并測量注射部位皮膚上的紅斑數(shù)量和大小，若大于5 mm，認為發(fā)生了皮膚過敏反應。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本試驗數(shù)據(jù)采用SAS9.2統(tǒng)計軟件進行處理，采用ANOVA程序?qū)?shù)據(jù)進行t檢驗分析。結(jié)果均用“平均值±標準差(mean±SD)”表示。以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果和分析

2.1 轉(zhuǎn)Bt基因糙米與親本非轉(zhuǎn)基因糙米中氨基酸含量的對比

對轉(zhuǎn)Bt基因糙米和親本非轉(zhuǎn)基因糙米進行營養(yǎng)成分對比分析，外觀來看，兩組大米均外觀均細長飽滿且均勻，兩者也均無異常氣味。轉(zhuǎn)Bt基因糙米和對照組親本糙米的主要營養(yǎng)成分含量見表2。關(guān)于轉(zhuǎn)基因糙米中晶體殺蟲蛋白(cry1Ac)含量檢測，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)Bt基因組糙米中cry1Ac的含量為0.25 μg/g，在對照組的非轉(zhuǎn)基因親本糙米中沒有檢測到殺蟲晶體蛋白。兩組數(shù)據(jù)均為均值(n=3)，可以看到轉(zhuǎn)基因糙米和對照組糙米營養(yǎng)成分相似，除晶體殺蟲蛋白(cry1Ac)外，其余成分均沒有明顯的差別。

表2 轉(zhuǎn)Bt基因糙米與親本非轉(zhuǎn)基因糙米中的營養(yǎng)成分含量Table 2 The amino acid compositions in GM and parental rice

2.2 轉(zhuǎn)Bt基因糙米對仔豬血清免疫球蛋白IgE、血清組織胺以及唾液皮質(zhì)醇含量的影響

飼喂轉(zhuǎn)Bt基因糙米后的斷奶仔豬的血清中IgE、血清組織胺含量如表3所示，兩組間差異不顯著(P>0.05)，唾液皮質(zhì)醇含量兩組間也無顯著差異(P>0.05)。

表3 轉(zhuǎn)Bt基因糙米對仔豬血液和唾液指標的影響Table 3 Effect of transgenic Bt rice on blood and saliva indexes in piglets

2.3 轉(zhuǎn)Bt基因糙米組與親本非轉(zhuǎn)基因糙米組仔豬血液中D-乳酸和二胺氧化酶含量對比

通過對轉(zhuǎn)Bt基因組和對照組仔豬血漿中D-乳酸和二胺氧比酶(DAO)進行分析檢測，如圖1所示，兩組間D-乳酸和DAO含量均無顯著差異，且試驗組的含量略低于對照組，說明進入血液中的D-乳酸和DAO量轉(zhuǎn)基因組少于對照組，表明轉(zhuǎn)Bt基因糙米對仔豬的腸道沒有造成損傷且腸壁更健康。

2.4 轉(zhuǎn)Bt基因糙米組與親本非轉(zhuǎn)基因糙米組仔豬皮膚致敏試驗結(jié)果對比

如圖2可見，在皮膚試敏30 min后，對皮膚注射點進行拍照觀察，進行評分，結(jié)果顯示兩組仔豬皮膚均未見紅斑，無明顯反應。

圖1 轉(zhuǎn)Bt基因糙米對仔豬腸道粘膜損傷的比較Fig.1 Comparison of Bt transgenic rice on the intestinal mucosal injury

圖2 仔豬皮膚致敏試驗結(jié)果a.對照組(親本非轉(zhuǎn)基因糙米組)；b.處理組(轉(zhuǎn)基因糙米組)Fig.1 Results of skin prick test in pigletsa.Control group;b.treatment group

3 討 論

3.1 轉(zhuǎn)Bt基因糙米營養(yǎng)成分含量對比

世界經(jīng)濟合作組織于1993年首次提出關(guān)于轉(zhuǎn)基因食品安全評價的方法-實質(zhì)等同原則。其具體內(nèi)容就是將轉(zhuǎn)基因食品與非轉(zhuǎn)基因的傳統(tǒng)食品的營養(yǎng)成分進行分析比較，如果轉(zhuǎn)基因食品與傳統(tǒng)的非轉(zhuǎn)基因食品具有實質(zhì)等同原則，就被認為是具有營養(yǎng)安全性。Sidu[7]、Aulrich[8]和Chenkova[9]等分別對抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因玉米中的粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、淀粉、粗脂肪、氨基酸和常量元素等的分析表明了抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米實質(zhì)等同。對于轉(zhuǎn)Bt基因的作物，Reuter[10]轉(zhuǎn)Bt基因的玉米中粗蛋白、淀粉、糖、非淀粉多糖、氨基酸、脂肪酸及一些金屬元素與傳統(tǒng)玉米無顯著差異。Cao等[11]對轉(zhuǎn)Bt Cry1c基因水稻T1c-19和親本大米明恢63的營養(yǎng)成分進行了比較，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大米與親本大米的營養(yǎng)成分相似。這也與本試驗的結(jié)果一致，本試驗對轉(zhuǎn)Bt基因的糙米與其親本的非轉(zhuǎn)基因糙米的粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、氨基酸水平等進行了檢測分析，結(jié)果顯示兩組間的營養(yǎng)物質(zhì)成分相似，無顯著差異，同樣符合實質(zhì)等同原則。

3.2 轉(zhuǎn)Bt基因糙米對斷奶仔豬的致敏結(jié)果分析

食物過敏癥是指幼兒期動物的常見疾病，主要以速發(fā)型的I型變態(tài)過敏反應為主。目前IgE成為了幾乎所有動物模型致敏模的標志性指標[12-13]。食物過敏反應基本上都是通過IgE介導的速發(fā)型過敏反應，介導皮膚的過敏反應。大量的研究報道指出，在人和動物發(fā)生食物過敏的反應過程中，能夠產(chǎn)生大量的IgE抗體，發(fā)生特異性的體液免疫反應[14-16]。產(chǎn)生的IgE抗體能夠迅速和小腸及其組織細胞上的親和力高的FcεRI受體結(jié)合，然后激活小腸肥大細胞，使其脫粒釋放組織胺、5-羥色胺及細胞因子等活性物質(zhì)，進一步導致機體發(fā)生超敏反應。之前也有研究發(fā)現(xiàn)，人類和動物在受到過敏原發(fā)生過敏反應時，產(chǎn)生的抗體也略有不同，如人類和大多數(shù)動物在發(fā)生變態(tài)反應時主要是由IgE抗體進行介導的抗原特異性。但有些動物在發(fā)生過敏反應和速發(fā)型變態(tài)反應時則是由IgE和IgG1抗體的抗原特異性進行介導。近年來，人們真的大豆蛋白作物食物致敏原引起任何動物的過敏反應做了大量的試驗研究，其過敏反應臨床表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹瀉、哮喘、蕁麻疹、過敏性皮炎、胃腸道損傷等[17],由于仔豬的消化生理和免疫反應等方面與人類有極大相似性，因此，目前仔豬成為了生物醫(yī)學研究人類過敏機理發(fā)生的一種重要的動物模型[18]。賈旭東等[19]利用BN大鼠為動物模型，對轉(zhuǎn)入抗蟲基因CpTI及選擇標記基因HPT的S86大米的致敏性進行了研究。大鼠在飼養(yǎng)六周后，S86大米飼料沒有激發(fā)大鼠體內(nèi)的IgE和IgG反應，組胺水平與陰性對照組無顯著差異(P>0.05)，也沒引起大鼠血壓方面的變化，表明了轉(zhuǎn)基因大米S86未對大鼠產(chǎn)生致敏性。之后，孫艷波等[20]利用用轉(zhuǎn)Bar基因水稻和親本非轉(zhuǎn)基因水稻飼喂小鼠90 d，持續(xù)3代，期間小鼠均未出現(xiàn)明顯的致敏反應癥狀，腸道粘液免疫球蛋白A(sIgA)、血清DAO和血清免疫球蛋白E(IgE)水平均無顯著性差異。Shim和利用轉(zhuǎn)基因大豆CP4EPSPS進行飼喂試驗，顯示轉(zhuǎn)基因大豆CP4EPSPS對動物體沒有致敏性[21]。對于轉(zhuǎn)基因大米的致敏研究方面，Domon等[22]利用轉(zhuǎn)基因水稻7Crp飼喂短尾猴，然后經(jīng)口灌胃后，無不良影響，未發(fā)現(xiàn)對試驗受試動物的健康有不利影響，同樣證明轉(zhuǎn)基因水稻7Crp具有食用安全性。本試驗同樣是利用轉(zhuǎn)Bt基因的糙米和非轉(zhuǎn)基因的親本糙米飼喂斷奶仔豬30 d，從結(jié)果來看，仔豬唾液皮質(zhì)醇、免疫球蛋白E(IgE) 、組織胺含量、血清二胺氧化酶(DAO)及D-乳酸等的檢測，結(jié)果顯示兩組間這五個指標均無顯著差異(P>0.05)，表明了轉(zhuǎn)Bt基因糙米未對仔豬造成過敏反應。

3.3 轉(zhuǎn)Bt基因糙米對仔豬消化道的損傷

消化道粘膜損傷臨床上通常使用腸粘膜通透性、腸粘膜pH、DAO活性和血漿內(nèi)毒素檢測等方法進行測定。本試驗采用血漿D-乳酸和DAO兩個腸道通透性的重要指標進行檢測。

D-乳酸是細菌的發(fā)酵代謝產(chǎn)物，腸道中的諸多細菌均可產(chǎn)生，在哺乳動物體內(nèi)不具備能夠?qū)⑵溲杆俜纸獾拿赶到y(tǒng)。由于腸壁缺血等原因?qū)е履c道粘膜損傷，進而腸粘膜細胞間緊密關(guān)聯(lián)性遭到破壞，腸壁的通透性增加后，腸道中的D-乳酸就會通過受傷腸壁入血，故檢測血中的D-乳酸含量可直接反映腸粘膜的受傷程度和腸道通透性的變化情況。動物試驗表明急性的腸缺血損傷導致血中的D-乳酸濃度迅速升高，腸粘膜的損傷評分值與血漿中D-乳酸的含量呈顯著的正相關(guān)。孫曉慶等[23]的研究表明了血漿中的D-乳酸和內(nèi)毒素的濃度變化有很好的相關(guān)性，且都與小腸腸壁的病理結(jié)果一致。與內(nèi)毒素相比，血漿D-乳酸的樣本采集、結(jié)果顯示、檢測等更為方便易行。因此血漿D-乳酸可作為腸道屏蔽功能障礙、腸道通透性增加的預警指標。

二胺氧化酶主要存在于哺乳動物體粘膜和絨毛上層，它可以氧化腐胺成為氨基丁醛，進一步環(huán)化成為高度活性的-吡咯啉，其活性與絨毛高度計粘膜細胞核酸蛋白質(zhì)密切相關(guān)。是反映小腸粘膜結(jié)構(gòu)和功能性的重要指標。目前，大多是通過分光光度計和放射活性測定法來檢測DAO含量。分光光度計法交放射活性法更為簡便、經(jīng)濟快速、重復性好，在臨床上應用較多。本試驗選用了D-乳酸和DAO兩個指標來對轉(zhuǎn)Bt基因糙米對仔豬消化道損傷進行了評價，結(jié)果顯示，兩組間的兩個指標間無顯著差異(P>0.05)。且試驗組的D-乳酸和DAO含量均略低于對照組。表明了相比對照組，轉(zhuǎn)Bt基因糙米未斷奶仔豬的消化道造成損傷。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，在斷奶仔豬日糧中添加70%的轉(zhuǎn)Bt基因糙米作為能量飼料，試驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)Bt基因糙米沒有對斷奶仔豬造成過敏反應，也未對仔豬的腸道粘膜和免疫系統(tǒng)造成損傷。

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TheSafetyEvaluationofTransgenicBtBrownRiceonPotentialAllergencityofWeaningPiglets

CAO Zheng-hui1,2，WANG Zhan-bin2，GU Xian-hong1*

(1.ChineseAcademyofAgriculturalSciences,InstituteofAnimalSciences,StateKeyLaboratoryofAnimalNutrition，Beijing100193,China;2.HenanUniversityofScienceandTechnology,CollegeofAnimalScienceandTechnology,Luoyang,Henan471003,China)

The experiment aimed to study the effect of transgenic Bt brown rice on allergencity of weaning piglets.Nutrient contents of transgenic Bt brown rice and non-transgenic parental brown rice were analyzed and compared.The diet was formulated based their nutrient contents.Thirty Large White×Danish Landrace weaning piglets at 21-d-old were selected and divided into two groups randomly (each group consisted of fifteen piglets and every piglets meant one repeat).The control group diet was comprised of 70% non-transgenic parental brown rice and the experimental group was comprised of 70% transgenic brown rice.The experiment period was 30d.Saliva and the vena cava blood were collected on 7 d and 28 d in the experimental period,respectively.Skin sensitive test of piglets was conducted on 25 d with standard substance of Cry1Ac which was expressed in rice by Bt.Amino acid level of two groups was analyzed and compared.The result showed that amino acid level was similar and had no significant difference (P>0.05).IgE and histamine content in serum,DAO activity and D-lactate content in plasma and Saliva cortisol content were analyzed.The result showed that these five indicators had no significant difference(P>0.05);The result of skin prickre actions test of Bt Cry1Ac protein on weaned piglets showed that no spiloplaxia was doserved in both groups.To conclusion,Transgenic Bt brown rice had no significant allergencity on piglets in this experiment.

Bt gene;brown rice;Cry1Ac;allergenicity

2013-11-06，

2013-12-03

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項課題(2012ZX08011001)

曹正輝(1987-)，男，河南新鄉(xiāng)人，碩士，主要從事營養(yǎng)生態(tài)學研究。E-mail: caozh0903@163.com

*[通訊作者]顧憲紅(1966-)，女，江蘇通州人，研究員，博士生導師，主要從事畜禽應激、福利與健康養(yǎng)殖研究。E-mail: guxianhong@vip.sina.com

S811.6

A

1005-5228(2014)03-0032-06