賴寶玲，王晨虹，周璐，王勤，蘇衛(wèi)蘭

(南方醫(yī)科大學附屬深圳市婦幼保健院 產科，廣東 深圳 518028)

胎盤兒茶酚氧位甲基轉移酶rs4818、rs4633位點基因多態(tài)性與子癇前期的關系

賴寶玲，王晨虹，周璐，王勤，蘇衛(wèi)蘭

(南方醫(yī)科大學附屬深圳市婦幼保健院 產科，廣東 深圳 518028)

目的探討胎盤兒茶酚氧位甲基轉移酶(catechol-o-methyltransferase，COMT)基因rs4818、rs4633位點單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與子癇前期發(fā)病的關系。方法便利抽樣法選擇2011年3月至2012年8月在南方醫(yī)科大學附屬深圳婦幼保健院產科住院分娩的孕婦217例，其中子癇前期孕婦92例為子癇前期組，健康孕婦125例為對照組。收集兩組孕婦產后胎盤組織，提取胎盤DNA，應用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix- assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometer，MALDI-TOF-MS)平臺及MassARRAY-IPLEX技術對COMT基因 rs4818及rs4633位點進行檢測,分析其基因型及等位基因分布情況。結果胎盤組織COMT基因rs4818位點基因型GG、GC、CC的基因型頻率和G、C等位基因頻率在子癇前期組與對照組之間的分布差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組胎盤COMT基因 rs4633位點CC、CT、TT三種基因型頻率和C、T等位基因頻率在子癇前期組與對照組之間的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論胎盤COMT rs4818、rs4633單核苷酸多態(tài)性與子癇前期發(fā)生無關。

子癇前期；兒茶酚氧位甲基轉移酶；基因多態(tài)性;胎盤

[Nurs J Chin PLA,2014，31(9)：30-32,42]

子癇前期發(fā)病率較高，是引起圍產期孕婦及新生兒發(fā)病的重要原因[1]。盡管研究多年，其病因和發(fā)病機制仍未明確。但胎盤被公認是子癇前期發(fā)病的關鍵因素。動物實驗[2]發(fā)現(xiàn)，胎盤兒茶酚氧位甲基轉移酶(catechol-o-methyltransferase，COMT)基因缺失的孕鼠出現(xiàn)子癇前期樣臨床及病理改變，如早產、血壓升高、尿蛋白升高等；胎盤出現(xiàn)類似人類蛻膜血管病變，且出現(xiàn)腎小球血管內皮病變。由此提出胎盤COMT低表達可能是子癇前期發(fā)病的啟動因素。前期研究[3-4]顯示，患重度子癇前期的漢族產婦胎盤COMT表達明顯低于對照組，而COMT是兒茶酚胺和雌激素代謝過程的重要酶。研究[5]表明，編碼COMT的基因具有遺傳多態(tài)性，而其常見的rs4818、rs4633位點基因多態(tài)性與基因表達、酶活性有關。因此，其編碼基因的多態(tài)性可能與子癇前期發(fā)生有關。目前，有關胎盤COMT基因多態(tài)性與子癇前期發(fā)病關系的研究鮮見報道。因此，本實驗擬通過基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術(matrix- assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometer，MALDI-TOF-MS)檢測胎盤組織COMT rs4818和rs4633兩個位點基因多態(tài)性，進一步探討與子癇前期相關的胎盤COMT低表達的上游原因。

1 對象與方法

1.1 研究對象 便利抽樣法選取2011年3月至2012年8月在南方醫(yī)科大學附屬深圳婦幼保健院產科住院分娩的孕婦217例，其中子癇前期孕婦92例為子癇前期組，健康孕婦125例為對照組，收集兩組孕婦產后胎盤組織。子癇前期診斷標準參照樂杰主編的《婦產科學》(第7版)，即孕20周后首次出現(xiàn)至少間隔6 h的2次血壓≥140/90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，且24 h尿蛋白定量≥300 mg。兩組孕婦均為中國漢族婦女、單胎無畸形。兩組孕婦年齡、產次分布均衡，且無慢性高血壓、心臟病、腎病、糖尿病及肝病病史。所有孕婦產前均簽署知情同意書，并報醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 胎盤娩出10 min內，從胎盤母體面中央無菌剪取約0．5 cm×0．5 cm×0.5 cm的胎盤絨毛組織(避開出血、壞死及鈣化區(qū)域)1塊，用磷酸鹽緩沖液(PBS，美國Hyclone公司)反復漂洗，干紗布吸除水分，裝入無菌無RNA/DNA酶凍存管-80℃冰箱保存待測。

1.2.2 基因檢測 應用MALDI-TOF-MS平臺及MassARRAY-IPLEX技術檢測COMT rs4818及rs4633位點基因型。TRIzol(Invitrogen公司)提取胎盤組織總DNA，用紫外分光光度計測定DNA純度和濃度。引物設計：采用Sequenom公司AssayDesigner軟件包設計擴增引物(見表1，引物設計合成均由深圳華大基因公司完成)。將DNA樣本稀釋到5 ng/μL，使用Ex Taq聚合酶，在384孔板常規(guī)擴增待測片段(PCR反應條件：94℃預變性15 s；94℃變性20 s、56℃退火30 s、72℃延伸1 min，進行45個循環(huán)；最后72℃延伸3 min)，然后在PCR產物中加入2 μL堿性磷酸酶(Shrimp alkaline phosphatase ，SAP)反應液，去除未反應完的dNTP(反應程序：37℃40 min、85℃5 min)，然后根據SEQUENOM程序進行單堿基延伸反應(single base extension，SBE)。所得反應產物加入6 mg樹脂脫鹽，混合后補充16 μL去離子水。用納升點樣儀將產物分點在質譜微陣列芯片上。

表1 COMT基因兩個位點SNP檢測的引物

2 結果

2.1 兩組孕婦胎盤COMT基因 rs4818和rs4633位點的基因型的Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢測 子癇前期組和對照組胎盤COMT rs4818位點和rs4633位點的頻率分布經擬合優(yōu)度χ2檢驗，均P>0.05，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(子癇前期組rs4818位點：χ2=2.566 ,P=0.11;rs4633位點：χ2=2.464，P=0.12；對照組rs4818位點：χ2=3.277，P=0.07；rs4633位點：χ2=2.724，P=0.10)，表明本研究所選的樣本代表性好。

2.2 兩組胎盤COMT基因 rs4818位點基因型及等位基因頻數(shù)分布 見表2。兩組胎盤COMT基因 GG 、GC、和CC基因型頻數(shù)分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；G、C等位基因頻數(shù)分布差異亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 兩組胎盤COMT基因 rs4818位點基因型頻率及等位基因頻率分布[n(%)]

2.3 兩組胎盤COMT基因 rs4633位點基因型及等位基因頻數(shù)分布 見表3。兩組胎盤COMT基因 CC 、CT、 TT各基因型頻數(shù)分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；且等位基因C、T在病例組和對照組頻數(shù)分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 兩組胎盤COMT 基因rs4633位點基因型頻率及等位基因頻率分布[n(%)]

3 討論

本研究應用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術檢測中國漢族產婦胎盤COMT基因 rs4818和rs4633位點基因多態(tài)性，分析其與子癇前期發(fā)生的關系。本病例對照研究未發(fā)現(xiàn)胎盤COMT rs4818和rs4633位點基因多態(tài)性與子癇前期的相關性。

COMT是廣泛存在于人體內的一種代謝酶，是兒茶酚胺和雌激素代謝的關鍵酶。編碼COMT基因位于22號染色體1區(qū)2亞帶，包含6個外顯子[5]。前期研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，重度子癇前期組胎盤COMT mRNA及蛋白表達均明顯低于對照組，但導致其低表達的上游機制不詳。研究[5]發(fā)現(xiàn)，COMT活性主要由遺傳因素決定，而COMT活性降低可導致兒茶酚雌激素代謝減慢，致使兒茶酚雌激素積聚，進而易發(fā)生多種疾病。較多資料[6-7]表明，COMT的基因多態(tài)性在不同種族和個體間的差異與精神疾病、慢性疼痛、乳腺癌、子宮內膜異位癥、絕經時間等有關。因此，認為COMT基因突變可能導致酶活性下降、兒茶酚胺滅活減少，二-甲氧雌二醇(2-ME)合成減少，可能增加子癇前期的危險[8]。COMT具有多個功能性單核苷酸多態(tài)性，rs4680、rs4818、rs6269和rs4633是研究最廣泛的位點。不同種族人群研究[9-11]發(fā)現(xiàn)，COMT基因多態(tài)性與子癇前期發(fā)病可能相關，然而對胎盤的相關研究缺乏。而胎盤是子癇前期發(fā)病的關鍵所在，因此研究胎盤COMT基因多態(tài)性更有助于揭示子癇前期病因。目前，檢測胎盤COMT基因多態(tài)性與子癇前期關系的研究僅見一篇[12]，該研究檢測72名正常產婦與13名子癇前期產婦胎盤COMT基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)COMT rs4818位點基因多態(tài)性AA基因型明顯增加子癇前期患病風險。本研究進行胎盤COMT兩個位點基因多態(tài)性檢測未發(fā)現(xiàn)兩組基因rs4818、rs4633位點基因多態(tài)性具明顯差異，說明COMT rs4818、rs4633位點基因多態(tài)性與子癇前期發(fā)生無相關性。然而子癇前期是一個多因素參與、多階段發(fā)展的復雜病變，很可能是由多基因決定和受多種環(huán)境因素影響的疾病[13-15]。而且COMT的基因型頻率及等位基因頻率分布在不同種族、群體、個體間存在差異[16-17]，加之抽樣本身存在的偏差和樣本量的大小都會對研究結果產生影響，單個SNP改變對疾病的影響較小，下一步加大樣本量進行多個SNP聯(lián)合檢測并進行單體型分析，有助于深入研究子癇前期病因與COMT的關系。

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(本文編輯：郁曉路)

AssociationbetweenPolymorphismsofPlacentalCatechol-o-methyltransferaseGeners4818、rs4633andPreeclampsia

Lai Baoling，Wang Chenhong，Zhou Lu，Wang Qin ，Su Weilan

Corresponding(Department of Obstetrics，Shenzhen Maternity and Child Healthcare Hospital affiliated to South Medical University，Shenzhen 518028, Guangdong Province,China)

Corresponding author: Wang Chenhong，E-mail: noralibrary@163.com

ObjectiveTo investigate whether polymorphisms of placental COMT gene are associated with preeclampsia，and to explore the role of COMT in the pathogenesis of preeclampsia.MethodsBy convenience sampling，217 patients were randomly selected including 92 patients with preeclampsia and 125 normal pregnant women.Placental tissue were collected and to extract DNA.Placental COMT (rs4818 and rs4633) polymorphisms were genotyped by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS) and MassARRAY-IPLEX.ResultsThere were no significant differences in placental COMT rs4818 GG，GC,CC genotypes frequencies and G，C allele frequencies and between patients with preeclampsia and control group (P>0.05).There were no significant difference between two groups of the placenta COMT rs4818locus CC，CT，TT in patients with preeclampsia and control group(P>0.05).ConclusionPlacental COMT rs4818 and rs4633 genotypes have no association with preeclampsia.

preeclampsia；catechol-o-methyltransferase (COMT)；gene polymorphism

2013-06-27

2014-02-10

深圳市科技創(chuàng)新委員會資助項目(180)

賴寶玲，博士，主要從事圍生期醫(yī)學研究

王晨虹，E-mail：noralibrary@163.com

10.3969/j.issn.1008-9993.2014.09.009

R473.71

A

1008-9993(2014)09-0030-04