李 瑞，謝 志，劉江偉，錢建輝，錢若筠，張 瓊，楊向新,楊 帆

創(chuàng)傷失血性休克容易誘發(fā)急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)等，均是危及生命的綜合征，導致高發(fā)病率和死亡率[1]。我國西北地區(qū)分布著大面積的戈壁沙漠，在夏季存在著氣溫高、晝夜溫差大、干燥等特點。因為戈壁沙漠環(huán)境惡劣，在此環(huán)境下更易造成機體損傷的加重，我們推測此環(huán)境下的創(chuàng)傷失血性休克更容易造成肺部損傷，但目前在國內(nèi)外尚未見沙漠干熱環(huán)境創(chuàng)傷失血性休克后繼發(fā)性肺部損傷的文獻報道，本實驗主要是在西北特殊環(huán)境人工實驗艙中(40°C，濕度10%)建立創(chuàng)傷失血性休克模型，研究COX-2在創(chuàng)傷失血性休克繼發(fā)肺損傷的變化規(guī)律及其與肺損傷機制的相關性，為沙漠干熱環(huán)境創(chuàng)傷失血性休克有效救治提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 實驗材料和儀器

140只SPF級，雄性SD大鼠，重約280～320g(新疆醫(yī)科大學實驗動物中心)； 丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)； COX-2引物: 上游： 5′-TGGTGCCGGGTCTGATGATG-3′,下游： 5′-GCAATGCGGTTCTGATACTG-3′; β-actin引物： 上游： 5′-AACCGTGAAAAGATGACCCAGAT-3′,下游5′-GTGGACAGTGAGGCCAGGAT-3′，(上海生物工程有限公司); TRIzon總RNA提取試劑(北京康為世紀生物科技有限公司)； 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量Mix(美國Invitrogen公司)。泰盟BL-420F機能系統(tǒng)； 電子顯微鏡； 酶標儀、熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)； 模擬環(huán)境在蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院研制的“西北特殊環(huán)境人工實驗艙”中進行。

2 實驗分組、模型建立及取材

實驗前大鼠常規(guī)自由進食、飲水，沙漠干熱環(huán)境創(chuàng)傷失血性休克組將各組實驗大鼠放置在西北特殊環(huán)境人工實驗艙內(nèi)，并使用沙漠干熱環(huán)境氣候模式(40°C，濕度10%)，讓大鼠自由活動預熱60min后，在人工實驗艙內(nèi)制造創(chuàng)傷失血性休克模型，模型參照孫英剛等[2]建立的創(chuàng)傷失血性休克模型并加以改進，采用3%戊巴比妥腹腔麻醉，使用靜脈留置針行右頸動、靜脈和右股動脈插管，右頸動脈插管接BL-420F生物機能監(jiān)測系統(tǒng)，用于測量血壓等血流動力學指標； 頸靜脈插管建立簡易補液通道； 右股動脈插管以備放血。留置針插管前均經(jīng)肝素鈉生理鹽水(500U/kg)抗凝，并連接三通管以方便監(jiān)測血壓及采血。大鼠穩(wěn)定10min后，利用250g鐵輪于30cm高度擊中SD大鼠左下肢股骨中上段造成粉碎性骨折，致傷后簡易包扎傷口，經(jīng)右股動脈放血使MAP維持在(35±5)mmHg[3]，若經(jīng)打擊后血壓不能維持則通過右頸靜脈補液通道輸注生理鹽水以維持平均動脈壓(MAP)。大鼠行動靜脈插管及創(chuàng)傷打擊模型完成時間控制在25～30min，并以大鼠MAP達到(35±5)mmHg為休克0h時間點。模型成功后轉(zhuǎn)移至常溫環(huán)境中(25°C,濕度35%)，常溫環(huán)境創(chuàng)傷失血性休克在常溫常濕環(huán)境中進行，其方法同干熱環(huán)境組，沙漠干熱環(huán)境對照組和常溫環(huán)境對照組除不致傷外其余步驟同實驗組，插管完成后即進行采血及組織取樣。分別按照設定的時間點處死大鼠，打開胸腔，游離、結扎右側(cè)肺葉，首先分離、剪開氣管首先進行氣管插管、固定，用5ml注射器，每次4ml 4℃生理鹽水緩慢推注、回抽，共灌洗肺5次，記錄回抽液體量，計算回收百分率(回收率需>80%，否則棄用)，-80℃凍存?zhèn)溆?，然后留取右?cè)肺，右肺上葉甲醛4%固定，然后脫水、包埋，其余-80℃凍存。

3 觀測指標及方法

3.1病理學變化及肺損傷病理學評分 由包埋好的肺組織，行常規(guī)切片、HE染色，觀察病理變化，同時由專業(yè)技術人員根據(jù)Mikawa、張素品等[4-5]標準做肺損傷評分,各按程度分為5個等級 ： 0分為無該項病理改變或極輕； 1分為病理變化輕且很局限； 2分為病理變化中等； 3分為病理變化中等但廣泛或局部顯著； 4分為非常顯著的廣泛性病理改變。每張切片隨機取10個高倍視野，每個視野病理評分為每項評分之和，10個視野的平均值為病理評分。

3.2肺灌洗液總蛋白量的測定 肺灌洗液由-80℃取出，4℃12 000轉(zhuǎn)離心10min，按照總蛋白定量測定試盒說明書步驟操作，于562nm處測定各管光密度(OD)值，根據(jù)公式計算最終濃度，統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)。

3.3肺組織MDA濃度、T-SOD活力測定 把肺組織由-80℃取出，稱取0.1g肺組織，在4℃生理鹽水中漂洗、拭干，于玻璃勻漿管中手工勻漿，用1ml生理鹽水沖洗轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管內(nèi)制備成10%的組織勻漿，3 000轉(zhuǎn)/min,離心10min，留取上清，MDA按照試劑說明書步驟操作，于460nm處，測定光密度(OD)值，而T-SOD活力測定首先根據(jù)預實驗確定最佳取樣濃度和最佳取樣量(2%組織勻漿，取樣量50μl)，按照試劑說明書步驟操作于550nm處，測定OD值，最后根據(jù)公式計算各樣本活性或濃度。

3.4肺組織COX-2 mRNA 表達量 肺組織按照北京康為世紀生物科技有限公司提供的TRIzon總RNA提取試劑說明書，提取總RNA并測量濃度，計算20μl反轉(zhuǎn)錄體系所需體積； 然后依據(jù)美國Invitrogen公司提供說明書以提取的總RNA作為模板配成20μl的體系，進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，最后以反轉(zhuǎn)錄出來的cDNA為模板配成20μl體系，在Bio-Rad實時熒光定量儀器上設定擴增參數(shù)： 95℃預變性3min； 95℃預變性10s，60℃復性30s，75℃延伸10s，共41個循環(huán)； 最后于75℃延伸10min，進行測定得出COX-2和內(nèi)參β-actin的ct值。

4 統(tǒng)計學分析

結 果

1 肺損傷病理學評分

常溫組與干熱組肺損傷評分在休克后各時間點均高于對照組(P<0.05); 干熱組休克后各時間點均高于常溫組,最大值(6.63±0.14)出現(xiàn)在1.5h時，常溫組最大值(5.50±0.20)在2.0h時出現(xiàn)，各時間點比較差異(P<0.05)(圖1)。

2 肺灌洗液總蛋白量

常溫組與干熱組肺灌洗液總蛋白量在休克后各時間點均高于對照組(P<0.05)； 干熱組休克后各時間點均高于常溫組，最大值(157.31±3.63)μg/ml出現(xiàn)在1.5h,常溫組最大值(117.29±5.97)μg/ml出現(xiàn)于2h，組內(nèi)休克后各時間點比較存在明顯差異(P<0.05)； 相關性分析發(fā)現(xiàn)其與肺損傷評分結果呈正相關，相關系數(shù)為R常溫=0.674、R干熱=0.795(P<0.05)(圖2)。

▲常溫組與干熱組各時間點與對照組比較均存在顯著性差異，△各時間點常溫組與干熱組比較，*常溫組各時間點比較，#干熱組各時間點比較，P<0.05

圖1 各組大鼠肺損傷病理評分

▲常溫組與干熱組各時間點與對照組比較均存在顯著性差異，△各時間點常溫組與干熱組比較，*常溫組各時間點比較，#干熱組各時間點比較，P<0.05

圖2 各組大鼠肺灌洗液總蛋白量

3 肺組織MDA濃度與T-SOD活力

干熱組MDA濃度休克后各時間點均高于常溫組，干熱組在1.5h時出現(xiàn)峰值，而常溫組峰值出現(xiàn)在2.0h時，組內(nèi)各時間點之間也存在差異(P<0.05)； 干熱組與常溫組MDA濃度均與肺損傷評分呈正相關，相關系數(shù)分別為R干熱=0.885、R常溫=0.757。而干熱組T-SOD活力休克后各時間點間均小于常溫組，在休克后0.5h處出現(xiàn)峰值，組內(nèi)各時間點間也存在差異(P<0.05)，與肺損傷評分呈負相關，相關系數(shù)分別為R干熱=-0.573，R常溫=-0.826(P<0.05)(表1)。

4 肺組織COX-2 mRNA表達量

常溫組與干熱組COX-2 mRNA表達量休克后各時間點均高于對照組(P<0.05)，干熱組休克后各時間點均高于常溫組，干熱組最大值(3.46±0.19)出現(xiàn)在1.5h早于常溫組最大值(2.13±0.13)(常溫組最大值出現(xiàn)在2h)出現(xiàn)，組內(nèi)休克后各時間點比較存在明顯差異(P<0.05)，相關性分析發(fā)現(xiàn)COX-2 mRNA表達量與肺損傷評分呈正相關，相關系數(shù)分別為R干熱=0.706、R常溫=0.761(P<0.05)(表1)。

表1 肺組織勻漿MDA濃度、T-SOD活力、COX-2 mRNA表達量

休克后各時間點與對照組比較:*P<0.05； 常溫組休克后各時間兩兩比較存在顯著差異:#P<0.05； 干熱組休克后各時間點間兩兩比較存在顯著差異:ΔP<0.05； 各時間點常溫組與干熱組比較:▲P<0.05

討 論

創(chuàng)傷失血性休克容易造成全身性缺血再灌注、多器官功能衰竭,其中急性肺損傷(ALI)作為全身炎癥反應綜合征(SIRS)一個重要組成部分經(jīng)常發(fā)生在創(chuàng)傷患者，在過去的10年中，盡管支持治療改善，ALI仍然具有很高的死亡率(26%～35%)[6-7]。沙漠戈壁在夏季存在著氣溫高、晝夜溫差大、干燥等特點，目前對于沙漠干熱環(huán)境中的創(chuàng)傷失血性休克的研究國內(nèi)外未見文獻報道，本實驗通過在西北特殊環(huán)境人工實驗艙中建立沙漠干熱環(huán)境創(chuàng)傷失血性休克模型，探討COX-2等在創(chuàng)傷失血性休克繼發(fā)肺損傷時的變化規(guī)律及其與肺損傷機制的相關性，為進一步研究提供理論依據(jù)。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)常溫組與干熱組肺損傷評分在休克后各時間點均高于對照組，且干熱組休克后各時間點均高于常溫組，干熱組峰值出現(xiàn)在1.5h早于常溫組峰值(2.0h)出現(xiàn)(P<0.05)； 常溫組與干熱組肺灌洗液總蛋白量在休克后各時間點均高于對照組，干熱組休克后各時間點均高于常溫組，峰值出現(xiàn)比常溫組峰值早，組內(nèi)休克后各時間點比較存在明顯差異(P<0.05)； 相關性分析發(fā)現(xiàn)其與肺損傷評分結果呈正相關，R常溫=0.674、R干熱=0.795(P<0.05)?？梢妱?chuàng)傷失血性休克大鼠繼發(fā)急性肺損傷時，沙漠干熱環(huán)境中高溫、干燥等特點一方面可能是通過使TAX2/PGI2動態(tài)平衡失衡，微血管強烈收縮、微血管內(nèi)血栓形成與堵塞等引發(fā)肺水腫、較嚴重組織細胞損傷，另一方面通過呼吸道直接對肺泡壁、血管上皮細胞產(chǎn)生損傷，導致細胞膜、血管基底膜完整性破壞、滲出增加，進一步加重肺損傷。

當氧自由基(ROS)生產(chǎn)超過其抗氧化能力，導致脂質(zhì)過氧化和隨之而來的組織損傷和細胞死亡[8]，MDA濃度高低間接反映機體細胞受自由基破壞的嚴重程度，而T-SOD活力可反映機體清除氧自由基的能力。該實驗結果顯示干熱組和常溫組肺組織勻漿MDA濃度在休克后各時間點均高于對照組(P<0.05)； 干熱組各時間點均明顯高于常溫組，干熱組在1.5h時出現(xiàn)峰值，而常溫組峰值出現(xiàn)在2.0h時，組內(nèi)各時間點之間也存在差異(P<0.05)； 但是干熱組和常溫組T-SOD活力在休克后各時間點均低于對照組，干熱組T-SOD活力休克后各時間點間均小于常溫組，在休克后0.5h處出現(xiàn)峰值，組內(nèi)各時間點間也存在差異(P<0.05)； 干熱組MDA濃度與肺損傷評分呈正相關，而T-SOD活力與肺損傷病理學評分呈負相關。兩者結合表明干熱環(huán)境中創(chuàng)傷失血性休克大鼠繼發(fā)性肺損傷可能是由于氧自由基大量產(chǎn)生，同時組織抗氧化能力減弱，導致脂質(zhì)過氧化損傷所引起。另外，沙漠高氣溫、干燥等因素可導致創(chuàng)傷失血性休克大鼠腸道細菌發(fā)生轉(zhuǎn)移，炎癥因子大量釋放，引起“呼吸爆發(fā)”、“二次打擊”等也可能是其較常溫組損傷嚴重且出現(xiàn)較早的原因之一。

眾所周知的環(huán)氧化酶(COX)是前列腺素(PGs)合成的限速酶，參與炎癥反應且在許多腫瘤組織細胞中COX-2的表達升高[9]。其中COX-2是誘導型，正常組織只有少量表達，但在多種細胞因子及促炎性物質(zhì)等能快速誘導其基因大量表達，生成COX-2催化產(chǎn)生大量PGs同時釋放ROS，PGs在ALI的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，亦可加重炎癥反應，引起收縮、組織水腫、滲出等[10]。該研究結果顯示常溫組與干熱組COX-2 mRNA表達量休克后各時間點均高于對照組(P<0.05)，干熱組休克后各時間點均高于常溫組，干熱組最大值(3.46±0.19)出現(xiàn)在1.5h早于常溫組最大值(2.13±0.13) 出現(xiàn)(常溫組最大值出現(xiàn)在2h)，組內(nèi)休克后各時間點比較存在明顯差異(P<0.05)，相關性分析發(fā)現(xiàn)COX-2 mRNA表達量與肺損傷評分呈正相關，相關系數(shù)分別為R干熱=0.706、R常溫=0.761(P<0.05)?？梢娚衬蔁岘h(huán)境中創(chuàng)傷失血性休克大鼠發(fā)生繼發(fā)性肺損傷較嚴重，損傷出現(xiàn)較早，可能是機體缺血、缺氧等因素使COX-2 mRNA的表達升高，肺組織TAX2/PGI2平衡失調(diào)，導致肺組織血管收縮，微血管通透性增加、微循環(huán)障礙等導致肺水腫，同時肺組織中性粒細胞扣押、聚集亦可誘導COX-2 mRNA高表達。另外最重要的可能是沙漠干熱環(huán)境中高氣溫、干燥等因素促使腸道細菌轉(zhuǎn)移、內(nèi)毒素休克提前出現(xiàn)時，可刺激COX-2 mRNA表達量增加，產(chǎn)生大量PGs和ROS等進而形成惡性循環(huán)，進一步加重對肺臟損傷。

同時最新研究發(fā)現(xiàn)LPS直接刺激成纖維細胞表達COX-2和PGE2，而Resolvin D1可通過減少COX-2的表達，對脂多糖(LPS)誘導的急性肺損傷起保護作用[11-12]。機械通氣所致肺損傷時，可通過抑制COX-2使炎癥介質(zhì)產(chǎn)生減少和水通道蛋白(AQP1)下調(diào)保護肺臟[13]。沙漠干熱環(huán)境創(chuàng)傷失血性休克大鼠繼發(fā)性肺損傷時，其主要特點是損傷較嚴重，損傷出現(xiàn)較早，因而COX-2可能成為沙漠干熱環(huán)境創(chuàng)傷失血性休克藥物干預治療的有效靶點，如何及時有效地通過阻斷COX-2途徑，防止肺損傷的進一步加重，有待進一步研究。

參考文獻:

[1] Briel M,Meade M,Mercat A,et al.Higher vs lower positive end-expiratory pressure in patients with acute lung injury and acute respiratory distress syndrome: systematic review and meta-analysis[J].JAMA,2010，303(9):865-873.

[2] 孫英剛，黃宗海，馮浩淼，等.創(chuàng)傷性休克大鼠模型的建立[J].解放軍醫(yī)學雜志,2002,27(12):1086-1087.

[3] Jellestad L,Fink T,Pradarutti S,et al.Inhibition of glycogen synthase kinase (GSK)-3-beta improves liver microcirculation and hepatocellular function after hemorrhagic shock[J].Eur J Pharmacol,2014，742：175-184.

[4] Mikawa K,Nishina K,Takao Y,et al.ONO-1714,a nitric oxide synthase inhibitor, attenuates endotoxin-induced acute lung injury in rabbits[J].Anesth Analg,2003,97(6):1751-1755.

[5] 張素品,張加艷，于泳浩，等.七氟烷后處理對大鼠肺缺血再灌注損傷的影響[J].中華麻醉學雜志,2009,29(8):753-756.

[6] Fan J.TLR Cross-talk mechanism of hemorrhagic shock-primed poulmonary neutrophil infiltration[J].Open Crit Care Med J,2010,(2):1-8.

[7] Erickson SE,Martin GS,Davis JL,et al.Recent trends in acute lung injury mortality: 1996-2005[J].Crit Care Med,2009,37(5):1574-1579.

[8] Lange M,Szabo C,Traber DL,et al.Time profile of oxidative stress and neutrophil activation in ovine acute lung injury and sepsis[J].Shock,2012,37(5):468-472.

[9] Li F,Liu Y,Chen H,et al.EGFR and COX-2 protein expression in non-small cell lung cancer and the correlation with clinical features[J].J Exp Clin Cancer Res,2011,(30):27.

[10] Wu CY,Chi PL,Hsieh HL,et al.TLR4-dependent induction of vascular adhesion molecule-1 in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts: roles of cytosolic phospholipase A(2)alpha/cyclooxygenase-2[J].J Cell Physiol,2010,223(2):480-491.

[11] Wang B,Gong X,Wan JY,et al.Resolvin D1 protects mice from LPS-induced acute lung injury[J].Pulm Pharmacol Ther,2011,24(4):434-441.

[12] Selige J,Tenor H,Hatzelmann A,et al.Cytokine-dependent balance of mitogenic effects in primary human lung fibroblasts related to cyclic AMP signaling and phosphodiesterase 4 inhibition[J].J Cell Physiol,2010,223(2):317-326.

[13] Jin LD,Wang LR,Wu LQ,et al.Effects of COX-2 inhibitor on ventilator-induced lung injury in rats[J].Int Immunopharmacol,2013,16(2):288-295.